免疫电泳（Immunoelectrophoresis）

在0.025～0.075之间。离子强度越低，缓冲液的电流下降，扩散现象严重，使分辨力明显降低。离子强度太高，将有大量的电流通过琼脂板，由此而产生的热量使板中水分大量蒸发，严重时可使琼脂板断裂而导致电泳中断。溶液中离子强度与溶液的浓度成正比。μ=1/2∑CZ2(μ为离子强度，C为克分子浓度，Z为离子的价数)；⑤电渗作用：电渗是在电场中液体对于固体支持物的相对移动。由于琼脂中含有SO42-，带负电荷，造成静电感应致使附近的水带正电荷，而向负极移动，所以电泳时有两种力，即电泳力和电渗力。如果物质原来带正电荷，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。如果物质向正极移动，所带电荷少，电泳力抵不过电渗力，则也向负极移动，血清中的γ球蛋白就是如此；⑥吸附作用：即介质对样品的滞留作用。它导致了样品的拖尾现象而降低了分辨率。纸的吸附作用最大，醋酸纤维膜的吸附作用较小或无；⑦电泳时间：电泳时间与迁移率成正比。电泳中常用仪器1．电泳仪2．电泳槽一般采用闭合式，即为了防止在电泳过程中产热，而使琼脂凝胶水分过度蒸发的设施。作电极用的铂金丝必须与电泳槽等长，这样电场才能均匀。电泳槽容量不宜过小，以防止溶液的浓度、pH值或离子强度发生改变，影响电泳条件的恒定性。琼脂的选择和制备电泳是利用一种支撑物作为一种介质让带电粒子通过，而其本身不发生变化。支撑物一般是采用琼脂或琼脂糖、纤维素膜、滤纸以及聚丙烯酰胺凝胶等。1．支撑物的条件⑴惰性物质，电泳后本身不发生变化。⑵制成凝胶后，其分子排列均匀，孔径大小一致便于带电质体自由通过。⑶透明、无杂质、电渗作用小，并且有一定的粘度与脆性。⑷价格便宜。一般多用琼脂粉或琼脂糖。琼脂糖是琼脂粉进一步提炼而成，很少或几乎无电渗作用。2．凝胶板的制备称取所需要量的琼脂粉，加入缓冲液（琼脂浓度一般1%～2％，琼脂糖0.75%～1.5％），同时加万分之一的硫柳汞防腐。水浴煮沸，待琼脂完全溶化后，液体清凉，再煮一段时间。选择适当大小的、无油腻、无划痕的干净玻璃板，根据所需的厚度（一般为2mm～4mm厚），计算好琼脂的用量。把玻片置于事先用水准仪测试的平台上，倒入熔化的琼脂，注意不要产生气泡。冷却后，按事先制好的图形大孔，用点水笔尖挑去孔内的琼脂，在火焰下轻烤以封底，以防止样品从琼脂底部泳过。然后加样，不用的琼脂板，放入冰箱中，注意防止干涸和冰冻。缓冲液的选择与配制常用的电泳缓冲液有以下两种。1． pH8.6离子强度0.025Mol/L～0.075Mol/L的巴比妥缓冲液，配制方法如表：表巴比妥缓冲液配制离子强度巴比妥钠(g) 巴比妥（g）加水至（ml） 0.075 15.45 2.76 1 000 0.050 10.30 1.84 1 000 0.025 10.30 1.84 2 000 2．pH8.6硼酸缓冲液，离子强度0.05Mol/L硼酸 6.70g硼砂（Na2B4O7·10H2O） 13.40gH2O 加至 1 000ml缓冲液配制后，加万分之一的硫柳汞防腐。两侧电泳槽加缓冲液至2／3～4／5的槽体积，注意两侧一样多，以免造成液面差，产生虹吸作用，影响电泳。当蛋白质泳动至槽内后，就应该更换缓冲液。有人认为长久电泳过的电泳液易于把血清中各成分分开，而新配制的则差一些。为了防止缓冲液离子强度的改变，可以在每次电泳时更换正负极（这是目前广泛采用的）；也可以在下一次电泳前，将两槽内的缓冲液混合后再用。但也有人认为不能混合再用，必须更新。电场强度的显示以V／cm长或I／cm宽表示。电压的测量必须用电压表测量凝胶板两端的电压差，再除以板长，而不能以电泳仪上的电压数表示，当然这两者有一定的相关性。电泳仪上的电流强度除以凝胶板宽即可代表电场强度。在实际工作中，很难有两项指标都符合的调控，因此只能根据取其一个指标进行调控，一般多按电流计算。结果观察与标本的保存对于与免疫有关的电泳，一般能形成明显的抗原抗体复合物，因此可以直接观察。也可以染色观察。染色后同时也起到了保存标本的作用。具体步骤如下：1．将琼脂板放入生理盐水中4℃浸泡2天～3天，每天换液数次，以洗去多余的蛋白质。2．染色将洗好的琼脂板放入氨基黑或偶氮胭脂红染色液中染色15min～30min。0.5％氨基黑染色液的配制：氨基黑4B（10B也可） 0.50g甲醇 5ml冰醋酸 10mlH2O 40ml0.75％偶氮胭脂红染色液的配制：偶氮胭脂红 1.50g甲醇 100ml冰醋酸 20mlH2O 80ml 先将染料放入研钵中，边研磨边加甲醇，使染料充分溶解，再加冰醋酸，最后加蒸馏水，以滤纸过滤，置棕色瓶保存。3．脱色染色后，将琼脂板放入脱色液中脱色，至琼脂板底色脱净为止，脱色液要勤换。脱色液的配制：乙醇 45ml冰醋酸 5mlH2O 50ml 脱色液用过后，可用活性炭吸附染色颗粒，过滤后，可再使用。4．漂洗用蒸馏水漂洗。5．制膜把琼脂胶滑到玻璃纸上，下垫一玻璃块，展平玻璃纸。在琼脂表面上抹一层甘油（以防干裂），放37℃温箱烘干即可。也可以先制膜后染色。对于非免疫性电泳标本的染色基本同于免疫电泳。但不要进行漂洗，电泳后直接投入染色液中或固定后投入染色液中。6．标本的保存主要是染色后拍照保存，也可制膜保存。电泳的分类1．根据支撑物的不同可分为：⑴凝胶电泳：如琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。⑵纸或纤维素膜电泳：如滤纸电泳、醋酸纤维膜电泳、硝酸纤维素膜电泳等。⑶粉末电泳：如淀粉、纤维素粉电泳等。2．根据电场强度的不同可分为：⑴低压电泳：电场强度1V/cm～5V/cm，电泳时间较长，可数小时至十几小时。⑵中压电泳：电场强度5V/cm～20V/cm，电泳时间一般数分钟至数十分钟。⑶高压电泳：电场强度20V/cm～200V/cm，电泳时间短，一般为数分钟至数十分钟。3．根据离子强度的不同而分为：⑴连续电泳：是指电泳槽缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的一致。⑵非连续电泳：使电泳槽内缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的不一致。一般常采用琼脂板的离子强度为电泳槽的一半。4．根据电泳的目的可分为：区带电泳、免疫电泳胞电泳等5．根据形状可分为火箭电泳、圆盘电泳等。
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