ques• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .Antibody Staining • Primary antibody may be directly labeled • labeled secondary antibody or more complex detection system. • secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source减少或消除非特异性染色的方法• 最常见原因 蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上• 最有效方法 1. 在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1:5-20）10-20min，2. 加入2-5%牛血清白蛋白可进一步减少非特异性染色，3. 用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）对照实验主要是针对第一抗体对照，常用方法：• 阳性对照：已知阳性• 阴性对照：1.已知阴性2.空白对照 BS代替特异性抗体3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体4.吸收实验:先用抗原吸收一抗5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗Antibody Detection • There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.1. Fluorescence 2. Enzyme-Mediated Detection3. 亲和组织化学（Affinity histochemistry）1. Fluorescence Directly Indirectly直接法 间接法补体法双标法使用荧光显微镜的注意事项• 暗室• 点燃汞灯5-15min,稳定后再开始观察• 光源寿命有限,应集中观察,防止反复点燃,灯熄后应充分冷却才能再次点燃,一次观察时间不能太长,以2-3h内为宜• 标本染色后应尽快观察,存放在4C能延缓荧光衰减,标本不能长时间暴露于紫外线荧光显微镜标本制作要求1.载玻片:厚度均匀,0.8-1.2mm之间,光洁,无自发荧光2.盖玻片:厚度0.17mm,光洁3.标本:不能太厚4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡2.Enzyme-Mediated Detection直接法(Direct) 间接法 (Indirect)基本原理• 以间接法法为例• 一抗是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80-90%多抗由家兔制得，单抗由小鼠制备）• 二抗为一抗（IgG）的抗体。• 优点：只要一抗来自同一种属，同一标记的二抗就能用来显示不同的抗原，避免了直接法标记每一种一抗，提高了敏感度。酶标抗体法的特点• 用于标记的酶应具备以下几点:1.酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，易于光、电镜观察2.所形成的终产物必须稳定,不能弥散3.较易获得,价廉,最好已商品化4.组织中不应存在内源性酶或类似物质5.酶应稳定,标记后保持酶和抗体的活性缺点 酶与抗体共价结合损害部分抗体和酶的活性三步法(HRP labelled)多层反应法Alkaline Phosphatase - Anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) Technique过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase ,PAP法)• 原理与酶桥法相似• 制备PAP复合物: 使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物PAP复合物的特征• 在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物• PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响• PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构PAP法的评价• 抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性• 灵敏度高:3个酶分子对应1个抗原• 不适合免疫电镜 AP复合物分子量大• 背景染色低假阴性及其处理假阳性及其处理1.组织细胞内色素: 如神经黑色素,可用AKP代替HRP2.假过氧化物酶活性: 如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)3.内源性过氧化物酶活性: 如粒细胞、巨噬细胞等，用AKP代替HRP4.游离醛基: 与蛋白质(含IgG)非特异性结合,用白蛋白预孵育封闭之5.疏水键和离子键: Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合,用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之6.天然抗体及不纯抗体: 增加一抗稀释度7.载体蛋白抗体: 制备半抗原的抗体时,使用了载体蛋白,用固相吸收技术将载体蛋白抗体除去增加染色强度方法1.重复显色2.重复一抗3.双桥PAP法亲和组织化学（Affinity histochemistry）• 新技术的出现----新进展• 特点 一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(Lectin)、生物素（Biotin）和葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein, SPA）等被应用于ICC，其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高亲和力为基础。它们既有别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，本质上又非抗原抗体反应。称为亲和组织化学（Affinity histochemistry）。广义的亲和组织化学包括：抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与抗生物素、 SPA与IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。• Avidin-Biotin interactions or other commercially-available amplifiers生物素-抗生物素基本原理• Avidin 卵白素，统称为抗生物素或亲和素 a basic glycoprotein，MW 68 Kd • biotin 生物素，small water soluble vitamin （vitamin H），MW 24Kd，• Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高（较抗原抗体高100万倍）的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(Avidin Biotin-Peroxidase Complex technique,ABC技术)ABC法的评价advantages1.敏感性强:亲和力强2.特异性强:一抗和二抗工作浓度低3.时间缩短4.多重标记注意事项1.内源性生物素活性:如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，预先用0.01%的抗生物素和0.01%生物素分别作用20min，每次作用后PBS5minX3次2.差异大,注意厂家、批号3.4C保存Disadvantages of ABC1.ABC的IP约为10, 中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合. 2.Avidin是glycoprotein, 与lectins等分子通过碳水化合物连接• 通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素) 代替avidin克服上述缺陷. • Streptavidin: a protein (MW 60 Kd) isolated from the bacterium Streptomyces avidinii(链霉亲生物素蛋白), and like avidin, has four high affinity binding sites for biotin. IP接近中性,在中性pH时很少带电荷, not a glycoprotein and therefore does not bind to lectins. 桥抗生物素-生物素技术(Bridged Avidin-Biotin technique, BRAB技术)标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)
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