单克隆抗体制备技术

个细胞/ml）。(5) 接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1~3天取1次，可取10次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。二、单克隆抗体的提纯1．材料(1) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液20 mMol/L NaCl(2) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液40mMol/L NaCl(3) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液80 mMol/L NaCl(4) 20mMol/L pH7.8~7.9Tris—HCl缓冲液(5) 饱和硫酸铵液(6) DEAE—纤维素柱2．操作方法（1）小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1.00×105转离心30min，去沉淀。（2）在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。（3）此溶液置冰中30min~60min，然后5 000r/min离心10min，去上清。（4）将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液（40mMol/L NaCl）中（溶液可能混浊）。（5）装入透析袋于Tris－HCl缓冲液（20 mMol/L NaCl）中透析除盐。（6）离心去沉淀。（7）溶液稀释（1:100或更高倍稀释）后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量1A 280unit=0.8mg蛋白质一般每ml腹水中，含有总蛋白约25mg~36mg。（8）过DEAE—纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为1ml~2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120 mMol/L ~150 mMol/L NaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG保存备用。杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免疫多次的多为IgG。三、单克隆抗体的鉴定1．杂交瘤细胞染色体的检查采用秋水仙素裂解法进行。2．单克隆抗体的类型、亚型的测定：购买兔抗小鼠Ig类型和亚型的标准抗血清，采用琼脂扩散法或ELISA夹心法测定单抗的Ig类型和亚型。3．单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。4．单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达5×104。而采用ELISA检查，腹水效价可达1.0×106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。5．必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。
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