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本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法。 1. 原理:经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 2. 标记步骤: (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。 (3) 将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。 (4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗体,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。 (5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。 (6) 将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过 < 1 > < 2 >
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