巨噬细胞的分离

使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单个细胞。4．以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g 10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1％和10％。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。5．离心200×g 10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。6．用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90％以上，巨噬细胞占全部细胞的90％以上。三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞1．用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640培养液（含1％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。2．离心200×g 10分钟，去上清液。用含1％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成约1×108～5×108/ml。
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