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与蛋白质载体功能基团所决定。常用的连接剂有二亚胺、二异氰酸、过碘酸盐等。（三）抗体的制备与提纯 见第八章免疫球蛋白的制备与提纯。（四）抗原的标记1．放射性同位素的选择 选择同位素的原则。⑴ 定方法简单、经济、便于推广应用。⑵ 易于防护。⑶ 同位素与标记物结合好，不易从标记物上脱落。⑷ 对标记物不引起辐射损伤，使蛋白变性。⑸ 具有较高的计数效率。目前常用的同位素有3H、125 I，其它还有14C、35S和32P等。① 3H 因所有的有机化合物中均含有氢，用3H来置换氢，不至于影响其原有化合物的化学性质。3H的半衰期长，是一个弱 衰变，能量低，便于防护。一次标记可以使用较长时间，采用闪烁仪测量，测量效力可达60%。3H标记要求条件较高，一般需由专门机构来承担，不易推广；② 125I 碘标记的化合物比度高，标记方法简便，而且标记物可在碘化钠晶体﹟型计数器上直接测定。125I发射 射线，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可用放射性I标记。目前，连接标记技术已有相当发展，致使许多非蛋白质和多肽的半抗原也可以用碘来标记。另外碘的放射能量较大，半衰期也较短。虽然125I的放射比活性仅为131I的13%，但125I的半衰期较131I长，同位素丰度大，辐射损伤小，计数效率也较高，因此125I比131I更为常用。表 各种标记同位素的性质比较 同位素 毒性分类 衰变类型 半衰期 3H 14C 131I 125I 35S 32P 低毒 低毒 高毒 低毒 中毒 中毒 － － · － EC· － － 12.26年 5730年 8.07天 60．20天 67.48天 14.26天 2．标记方法 目前常用的是碘标记法。碘化标记的方法很多，如氯化碘法、乳过氧化酶法、过氯酸法和连接标记法等。但比较起来，氯胺T法最为简便，效果好，易于采用。氯胺T碘化标记法的原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液中可以缓慢地释放次氯酸，因而可以在标记的过程中形成一种能产生温和氧化效果的中间体，它可使放射性碘离子氧化而呈活泼形式的碘离子，并取代抗原分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或二个氢原子，使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。其记过程为：⑴ 将蛋白质抗原以0.5Mol/L pH7.5PB液稀释为20μg/μl，取5μl~10μl。⑵ 取Na125I 5μl(含2mci~3mci)。⑶ 将1mg氯胺T溶于0.5Mol/L pH7.5PB液 0.1ml中。⑷ 再将Na125I和氯胺T分别缓缓加入蛋白质液中，于冰浴中边加边搅拌，加完后再搅拌5min。⑸ 加0.1ml(含3mg)偏重硫酸钠(以PB液配制)。⑹ 再加1%碘化钾液1滴，看液体是否完全透明。如仍呈棕色，应继续加少许的偏重硫酸钠。⑺ 过SephadexG50柱，取第一峰，即为碘标记的蛋白质抗原。3．标记的最佳条件⑴ 放射性碘比活性要高。⑵ 反应体积要小。⑶ 标记反应的pH值，以pH7.5为宜，超过8.5，碘则取代酪氨酸以外的其它成分。⑷ 氯胺T的用量必须事先测定。其方法为定出在标记的蛋白质存在时，10%的三氯醋酸能沉淀最大量放射性碘所需要的最小量的氯胺T。氯胺T的用量必须适当。用量少，虽能满足反应的要求，但产率低；用量大易使蛋白质变性。⑸ 蛋白质的浓度决定碘化的效率。对含量中等的氯胺酸的蛋白质而言，在蛋白质浓度为1mg/ml，蛋白质的回收率为100%，浓度为300μg/ml，则为80%～90%，当浓度降至50μg/ml时，则回收率只有60%～70%。4．标记物的鉴定⑴ 放射性化学纯度鉴定是指某一化学形式的放射性物质的放射强度在该样品中所占放射性总强度的百分比。鉴定方法为：取标记的蛋白质或多肽抗原液少许，加入1%～2%载体蛋白及等量的15%三氯醋酸，摇匀静置数分钟后，3 000r/min离心15min分别测上清液(含游离碘)及沉淀(含标记抗原)的放射活性。一般要求游离碘含量占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮藏较久后，仍有部分放射碘从标记物上脱落下来，使用时应除去后再用，否则影响放射免疫分析的精确度。⑵ 免疫化学活性鉴定：采用碘标记的抗原，通常由于氧化剂的作用可引起部分活性的损伤，而采用3H、14C等标记的抗原，则不改变抗原的化学结构。免疫活性的检查方法：以小量的标记抗原加过量的抗体，在适当的条件下充分反应后，分离B、F，分别测定其放射性，算出百分结合率。此值应在80%以上，最大可超过90%。该值越大，表示标记的免疫化学活性损失越少。⑶ 放射强度：放射性强度以比度表示。即单位重量抗原的放射性强度。比度越高，敏感性越高。因此根据测定需要的敏感度，要求适当比度的标记抗原。标记抗原比度的计算是依据放射性碘的利用率。（五）B、F分离 当标记的抗原与未标记的抗原和抗体结合后，均形成抗原抗体复合物。由于其浓度低，不能自动沉淀。而放射免疫测定的终点决定于标记抗原与竞争者的结合比，因此将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离得完全与否是放射免疫测定的关键。分离技术的选择是根据抗原的特性、待测生物液体的体积、测定需要的敏感度、精确性以及技术上可达到的熟练程度等。较常用的B、F分离法见表13-2。表13-2 B、F分离法 分离方法 (B) 抗原抗体复合物 (F) 游离抗原 平衡透析 清蛋白或葡聚糖衣 活性炭吸附 凝胶过滤 微孔滤膜过滤 电泳和层析电泳 双抗体法 固相抗体法 硫酸胺沉淀法 聚乙二醇(分子量6 000) 在透析袋内 不被活性炭吸附离心 后于溶液中 先被洗脱 在醋酸纤维膜上 在 球蛋白电泳带 被第二抗体沉淀 结合到固相物上 离心后于沉淀中 离心后于沉淀中 袋内外浓度相等 被活性炭吸附于沉淀中 后被洗脱 通过滤膜被洗掉 以其自己的电泳泳动度移动 离心后在上清液中 在溶解相中 在溶液中 在溶液中 1．盐析法 利用33%饱和硫酸铵液可使其抗原抗体复合物沉淀下来。向溶液内加入饱和硫酸铵，使其最终饱和度达到36%左右，摇匀静置，然后离心沉淀即为标记抗原抗体复合物，而游离的标记抗原仍留于溶液中。此法的缺点是，游离抗原也同时有随标记抗原抗体复合物沉淀的可能。2．双抗体法 双抗体法是目前常用的方法，抗体在与标记抗原结合后，同时还具有对抗抗体的结合能力，因此用第一抗体动物的提纯的免疫球蛋白去注射另一种动物，获得第二抗体(即抗抗体)。当第一抗体与标记抗原形成复合物时再遇上第二抗体即形成 *Ag－Ab1－Ab2(也有Ag－Ab1－Ab2)更大的复合物而沉淀下来。达到与游离的抗原分离的目的。此法比较温和，分离也较完全(可达80%～90%)。3．清蛋白(或葡聚糖衣)活性炭吸附法 是将活性炭悬浮于一定浓度的葡聚糖水溶液中(或清蛋白)，葡聚糖分子在活性炭表面形成一层具有一定孔径网眼的膜，这层膜只允许较小的分子吸附于上面，进而被活性炭所吸附，大分子的物质被排在门外，不被活性炭吸附。从而达到分离的目的。最佳分离条件是pH6.5～9.4℃，15min～30min。此法快速、方便而且分离效果好。但是当标记抗原与抗体结合不牢固时，待游离抗原被活性炭吸附后打破了抗原抗体反应的平衡，而造成抗原抗体复合物的离解。在这种情况下，此法不能应用。（六）标准曲线的制作 标准曲线的制作直接影响到放射免疫测定的敏感性、精确度和工作范围。1．抗体滴定曲线的制作 将抗体进行不同的稀释，然后加入等量的标记抗原和非标记已知抗原，分离结合的和游离的标记抗原，测出B/F比率，然后与抗体稀释度(做横轴)作图，绘制曲线。以能结合50%标记抗原的抗体稀释度作为试验中的抗体用量。2．标准曲线的制作。根据抗体滴定曲线，求出能结合50%标记抗原的抗体用量，以此制作标准曲线(又称抗原相加线)。以此抗体用量，加入不同稀释度的已知抗原和标记的抗原作用一定时间后，分离B、F，测B的放射性，以标记Ag与抗体复合物的脉冲数或结合率为纵坐标，以未标记抗原浓度的对数为横坐标作图。如得不到直线可通过logit计算，将曲线换成直线。在坐标上，曲线的斜率最大的部分是放射免疫测定的工作范围。斜率越大，敏感性越高，测定范围小。斜率小，工作范围大，而敏感性就较差。在同样条件下，测未知样品时，只要测出标记抗原与抗体复合物的放射性，算出结合率，就可以从标准曲线上查出未知抗原的含量。
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