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95%~100%乙醇 室温3~10 酶、激素 丙 酮 4℃ 30 免疫球蛋白 四氯化碳 病 毒 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 室温5~10或4℃ 30~60 多糖、细菌等 微火加热,甲醇、10%甲醛、丙酮 室温5~10或4℃ 30~60 类 脂 (异嗜性抗原) 10%甲醛,10%佛茂尔(ForMol) 室温3~10 (三)水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光。(四)染色染色分直接染色法与间接染色法。1. 材料与试剂(1)荧光抗体,稀释至应用浓度。(2)0.01Mol/L pH7.4PBS液(3)9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。(4)带盖方盘2.直接染色法(1)将固定好的玻片置于湿盘中,滴加荧光抗体染色液,以覆盖为度,加盖,37℃感做30 min~45min。(2)PBS冲洗3次,每次冲洗3min,即3×3ˊ冲洗。(3)蒸馏水冲洗。(4)滴甘油缓冲液一滴,封片,荧光显微镜检查。2. 间接染色法(1) 检查抗原:①取固定标本,加已知的免疫血清,37℃孵育30min;②以PBS液3×3ˊ冲洗;③再加荧光标记的抗抗体,37℃孵育30min;④PBS 3×3ˊ冲洗;⑤H2O冲洗,凉干;⑥加甘油缓冲液,封片、镜检。(2) 检查抗体:①以免疫后动物的淋巴组织涂片,自然干燥,甲醇固定;②滴加相应抗原液(按1﹕100~1﹕500稀释),37℃孵育30min;③PBS液3×3ˊ冲洗;④加荧光抗体,37℃孵育30min;⑤PBS液3×3ˊ冲洗;⑥水洗,凉干;⑦加甘油缓冲液,封片、镜检。 (五)结果显示 荧光显微镜所观察到的图象,主要以两个指标判断结果,一个是形态学特征;另一个是荧光的亮度,在结果的判定中,必须将二者结合起来,综合判定。荧光强度的表示方法如下:+++ ~ ++++:荧光闪亮,呈明显的亮绿色。++ :荧光明亮,呈黄绿色。+ :荧光较弱,但清楚可见。± :极弱的可疑荧光。- :无荧光。(六)标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的,因此随着保存时间的延长,在各种条件影响下,标记蛋白可能变性解离,失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难,所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。保存的方法可采取以下几种:①固定标本片以后低温保存,随用随染;②染色片采取优质封固剂,如特别的荧光封固剂(Fluormount)或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发,封固后低温保存;④可以采用拍照保存照片。 < 1 > < 2 >
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