中性粒细胞碱性磷酸酶活性定量测定法

滤后保存于冰箱内。用时稀释一倍。　　ｉ．标准磷储备液（每毫升含无机磷１ｍｇ）：　称取干燥恒重的分析纯磷酸二氢钾２．１９７１ｇ置于容量瓶中，加重蒸馏水至５００ｍｌ，加氯仿２滴，在冰箱内保存。　　ｊ．肝素：用生理盐水配成１％溶液。　３实验方法　　３．１　白细胞分离　　自耳垂或手指取血０．１５ｍｌ，置于预先准备好的含１滴肝素和０．３０ｍｌ葡聚糖溶液的微量试管中，用手振摇混匀，静置１０分钟。待红细胞沉降界面清晰时，小心吸出上层悬浮液，置于小离心管中，加入２倍生理盐水，摇匀后离心（２５００转／分钟）８分钟。取出上清液弃去，保留沉淀。再向有沉淀的离心管加生理盐水２ｍｌ，混匀，再离心８分钟。重复２次，弃去上清液，管中留下液体约０．１５ｍｌ，与沉淀混匀，即为白细胞悬浮液，作白细胞计数２～４次，取其平均值。此白细胞悬浮液供酶活性测定之用。如不能立即测定，需放置冰箱内，但必须在当天测定。　　３．２　白细胞碱酶活性的测定　　取一小试管，加入β—甘油磷酸钠０．８５ｍｌ，皂素０．０５ｍｌ，氯化镁０．０２ｍｌ，于３７℃水浴中预热５分钟，然后准确加入白细胞悬浮液０．０５ｍｌ，混匀，继续保温６０分钟，到时立即加入５０％三氯乙酸０．１５ｍｌ使反应终止，以２５００转／分离心１０分钟，除去沉淀。　　每个样品都需作对照管测定，对照管所加内容物同上，仅白细胞悬浮液须在保温后加５０％三氯乙酸后加入。　　分别取样品和对照管上清液０．８０ｍｌ，各加入钼酸铵试剂０．１５ｍｌ，氨基萘酚磺酸溶液０．１０ｍｌ，重蒸馏水１．４５ｍｌ，显色２０分钟，用分光光度计测定光密度（所用波长为６６０ｎｍ、比色杯厚１０ｍｍ），分别读取样品管、对照管的光密度。每管重复读数两次，取其平均值。　　３．３　磷标准曲线的制定　　取标准磷储备液，用５％三氯乙酸稀释成不同浓度的标准磷应用液，浓度分别为：１．０，３．０，５．０，７．５，１０．０ｍｇ／１。然后取试管５支，分别在每一试管加入１．０ｍｌ上述标准磷应用液之一种，以及钼酸铵０．１５ｍｌ，氨基萘酚磺酸０．１０ｍｌ，重蒸馏水１．２５ｍｌ，按上法显色，读取各管的光密度，绘制标准曲线图。　　３．４　白细胞分类计数　　在取血分离白细胞的同时，取１滴血作涂片，瑞氏染色，按常规分类计数嗜中性白细胞的百分比。　　３．５　计算方法　　白细胞碱酶活性用单位表示，以每十亿个中性白细胞在３７℃条件下，１小时释放出１ｍｇ无机磷为一个单位。计算公式如下：　　　酶活性（单位）＝｛〔ｐｉ（样）—ｐｉ（对）〕×１００００×１．４０｝÷（Ｗ·Ｖ·Ｎ）式中：ｐｉ（样）——样品管无机磷，μｇ；　　　ｐｉ（对）——对照管无机磷，μｇ；　　　　　　　Ｗ——白细胞悬液的白细胞数，个／立方毫米；　　　　　　　Ｖ——酶反应所加入白细胞悬液的量，ｍｌ；　　　　　　　Ｎ——嗜中性白细胞，％。　　注：为减少操作误差，提高结果准确性，也可自静脉采血１．５ｍｌ，按常量法进行操作。详见《卫生研究》５（６）：４８１，１９７６。　４　注意事项　　ａ．白细胞悬液必须充分摇匀，不应有聚集的细胞。白细胞计数要准确，一般应计数２～４次，取平均值。　　ｂ．碱酶活性测定中，白细胞悬液的加入量要准确，吸取时注意摇匀。　　ｃ．碱酶反应保温时间（６０分钟）要准确。　　ｄ．显色反应不应出现沉淀。　　ｅ．用分光光度计读数时，样品管与对照管都应重复两次。
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