免疫血清的制备

人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。　　3.　第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧　窝及鼠蹊部皮下。　　4.　间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。　　5.　若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。　　三、放血　　(一)　心脏采用血法　　1.　家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；　　2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮肤；　　3.　用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位；　　4.　用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死；　　5.　将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。　　(二)　颈动脉放血法　　1.　家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤；　　2.　沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌；　　3.　分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离；　　4.　于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住；　　5.　用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱；　　6.　松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。　　四、分离血清　　将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01％硫柳汞或0.02％叠氮钠，最终浓度)，分装后置4℃冰箱中保存备用。　　五、结果鉴定　　以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。　　六、材料　　(一)　动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。　　(二)　器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。　　(三)　试剂　　1.　灭菌生理盐水；　　2.　纯化人IgG(10mg／ml)；　　3.　消毒酒精及碘酒；　　4.　羊毛脂；　　5.　石蜡油；　　6.　活卡价苗(BCG)(75mg／ml)；　　7.　弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌(8磅20分钟)后保存备用。　　8.　弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA予温(60℃30分钟)，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG(75mg／ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml(2.4mg／ml)牨_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。　　七、注意事项　　1.　免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。　　2.　免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。　　3.　佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。　　4.　抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以0.5mg／kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。　　5.　免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮-射，同时于两侧肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml，间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。
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