DNA的凝胶电泳

标准高强度低熔点低粘度低熔点 0.3 0.5 700bp～25kb 0.8 500bp～15kb 800bp～10kb 800bp～10kb 1.0 250bp～12kb 400bp～8kb 400bp～8kb 1.2 150bp～6kb 300bp～7kb 300bp~7kb 1.5 80bp~4kb 200bp~4kb 200bp~4kb 2.0 100bp~3kb 100bp~3kb 3.0 500bp~1kb 500bp~1kb 4.0 100bp~500bp 6.0 10bp～100bp 由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DN-段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DN-段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。DNA电泳影响因素 DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。 ⑴DNA分子大小 DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。 ⑵DNA分子构型对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。 ⑶不同的胶浓度对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于DN-段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DN-段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。 ⑷电场强度电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DN-段的降解。实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。 ⑸溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。 ⑹电泳缓冲液目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2.2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。表2.2 常用DNA电泳缓冲液 DNA电泳上样缓冲液电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下：（1）螯合Mg 2＋，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/l的EDTA。（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓冲液，DNA样品中仅需加入1/10的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。DNA电泳上样量的控制在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带即可观察到清晰结果，而对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。而对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带，上样量即使超过10mg条带也不会托尾，而单一条带（>10 kb）当上样量超过200ng就有可能产生托尾现象。DNA电泳的标准分子量目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于PCR产物鉴定的小分子Marker，也有常规用的大分子Marker，图2-1为TAKARA公司提供的DNA标准分子量电泳（示意）图图2-1 常用的DNA标准分子量电泳图2.2 试剂与器材 1. 试剂（1）50×TAE电泳缓冲液 242.0g Tris碱 100ml 0.5mol/EDTA（pH=8.0） 57.1ml 冰醋酸（2）EB母液（1mg/ml）称取一定量的EB溶于无菌水中，室温避光保存凝胶中浓度为0.5mg/ml EB为强诱变剂，实验中要防止污染（3）DNA标准分子量（自制）片段大小依次为：0.5，1.1，1.6，2.7，3.1，4.1，5.4，9.4和17 单次电泳电样量3～4ml即可，回收电泳加倍（4）10×Loading buffer（pH7.0） EDTA 50mM 甘油 60% Xylene Cyanol FF（W/V） 0.25% Bromophenol Blue（W/V） 0.25% （5）无菌双蒸水（6）琼脂糖 2. 器材（1）eppendorf管（2）枪头（3）移液器（4）电泳槽（5）电泳仪（6）微波炉（7）电泳板和梳子（8）紫外投射分析仪（9）数码相机（带紫外滤色镜和近射镜）实验步骤 (1) 用1×TAE–Buffer按照被分离DNA分子的大小配制一定浓度(0.7%)的琼脂糖凝胶50ml，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。 (2) 待溶液冷却至50℃左右，加入溴化乙锭（贮存液: 用水配制为1mg/ml）至终浓为0.5mg/ml充分混匀。 (3) 用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5~1.0mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在3~5mm之间。 (4) 在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE缓冲液的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1mm。 (5) DNA样品与10×Loading-buffer(含有溴酚蓝和甘油等物质)混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。 (6) 盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极（红线）移动，采用电压为80～100V。 (7) 溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板，在紫外灯下观查凝胶。（注：对于DN-段回收的电泳一般建议采用0.6%低浓度的凝胶，而且采用的电泳液需第一次使用，电泳槽要洗净）
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