耐热DNA聚合酶综述

校读功能的DNA聚合酶或TherminatorTM DNA聚合酶。根据不同的反应体积相应调整用量。一般来说，如果模板的浓度较低，聚合酶用量也相应减少（即减少至推荐用量的下限）。DNA聚合酶的推荐用量:VentR、Deep VentR 和9°Nm DNA聚合酶：0.25－2个单位/100 μlVentR（exo-）、Deep VentR（exo-）和Taq DNA聚合酶：2－4个单位/100 μl退火温度: 最适退火温度可采用几种标准的方法计算。如果实验结果不理想，提高退火温度4－7°C（每种聚合酶结合DNA的Km值不同，故不同的聚合酶需要不同的退火温度）。镁离子浓度: 使用VentR DNA聚合酶时，最适镁离子浓度一般为2 mM（1× Thermopol Reaction Buffer），但以下几种情况需要重新调整镁离子浓度：1)模板长度超过2 Kb；2)反应体系中有较多的EDTA；3)PCR产物出现拖尾，通过减少聚合酶用量仍不能改善时。当出现以上任何一种情况时，建议设计一系列反应体系，镁离子浓度由2 mM逐渐增加到8 mM。注意：与VentR和Deep VentR DNA聚合酶相比，镁离子浓度的变化对9°Nm和Taq DNA聚合酶的影响不大；尽管有些反应体系要求1 mM的镁离子浓度，通常也可使用2 mM的镁离子浓度。模板浓度: DNA来源种类繁多，从质粒DNA（数千个碱基对）到基因组DNA（百万个碱基对）。进行PCR反应之前，应仔细分析靶基因序列在整个DNA体系中所占的比例，来推断所需的每种成分的浓度。使用NEB具有校读功能的VentR、Deep VentR 或9°Nm DNA聚合酶时，模板DNA的起始浓度最好为：质粒DNA（1-10 ng）；粘粒和cDNA（10-100 ng）；基因组DNA（100-500 ng）。同Taq DNA聚合酶一样，不具有校读功能的VentR（exo-）和Deep VentR（exo-）对模板量的要求不严格，即使很少的模板也能成功地完成PCR反应。使用要点模板链中如有次黄苷或脱氧尿苷，可能影响NEB的VentR、Deep VentR、Therminator和9°Nm DNA聚合酶的催化作用，而Taq DNA聚合酶不受这些核苷酸的影响。由于具有校读功能的DNA聚合酶只从3末端切除单链DNA，这类酶也不会去除5末端突出的DNA（引物的5端可不与模板完全互补配对，如引物设计有新的内切酶识别序列时）。如选用具有校读功能的DNA聚合酶来扩增与模板有错配点的引物，设计引物时要仔细考虑错配点的位置。在PCR过程中，具有校读功能的DNA聚合酶一般是每次从单链DNA（引物）的3末端降解一个碱基，因此在引物与模板复性之前，引物中含错配点的那部分可能就已经被降解了。长链引物比短链引物的初始降解速率高,60 mer的引物比24 mer的引物降解得更快，而15 mer的引物几乎不被降解。总之，引物长度在20-35个碱基之间为宜。任何长度的引物，5末端的15个碱基一般不会被降解，3末端被改变的碱基则很可能被外切酶活性切除。引物链中间位置的碱基离3末端距离越远，就越不容易被降解。如要避免引物被降解，合成引物时可以将3末端的最后两个碱基采用硫代磷酸酯联接（phosphorothioate linkage）。这种连接方式保留了引物的可延伸性，而且可避免被降解[de Noronha, C.and Mullins, J. (1992)PCR Methods and Applications 2,131-136]。使用VentR和Deep VentR DNA聚合酶时，每种dNTP的浓度要求在200-400 μM之间，这样可确保VentR DNA聚合酶不发挥3→5校读外切功能降解DNA产物。合成DNA的过程中，当dNTP完全被消耗后，降解可能会发生。如要检测是否出现降解，可以取少量反应中间的反应混合物与终产物进行比较。延伸时间可以根据在72-75°C时，每延伸1 Kb需要1分钟的方法来计算。这种延伸时间∶产物长度比的计算方法适用于50-15,000 bp长度的产物。应用具有校读功能的DNA聚合酶时，延伸时间最好不要超过理论计算时间。加入所有PCR反应成分时应保持温度在0-4°C，也可以先加入除聚合酶外的所有反应成分，待第一步高温变性后，再加入DNA聚合酶。
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