PCR应用中存在的问题

效率特别高，所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现假阳性。交叉污染的处理方法包括 [1] ： 1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物以破坏污染的 PCR 产物。一般选用波长 254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ， 34:27 ） 2 ． PCR 实验中使用 dUTP ，而不用 dTTP 。在扩增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）处理可降解交叉污染的 PCR 产物，而不降解基困组 DNA 模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应（ Gene ， 1990 ， 93 ： 125 ）。美国 PE 公司提供此类试剂盒（ PCR carry-over preventionkit 。 3 ．在 PCR 反应前加入一种光化学试剂，反应完成后激活该试剂，光化学试剂可交联 DNA 链，使之不能再扩增（ Nucleic Acids Res ， 1991 ， 19 ： 99 ）。二、假阴性：　　如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。但这里应注意，许多国产 PCR 试剂盒中阳性对照采用质粒 DNA ，和标本相比来说，不需纯化提取核酸的步骤，因此，如果在标本核酸纯化提取步骤有问题，即使阳性对照均呈阳性，标本检测中还可能有假阴性。　　造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、 SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性 [2] 。　　设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。三、PCR产物的鉴定　　PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来， PCR 产物均应通过实验证实其特异性。在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。　　综上所述， PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段，但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高 [9] 。目前的关键问题是如何正确应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具备开展 PCR 需要的条件， PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前，只有针对 PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用 PCR ，才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。　参考文献 [1] Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 1992, 252:1643. [2] 叶顺章，聚合酶链反应在性病诊断中的应用，中华皮肤科杂志， 1996 ， 29/p> [3] Billiald P, Goyffon M, PCR: principles and prospects in clinical bilology. Ann Pharm Fr, 1995,53(4):155
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