异源双链分析（HA）

91年a,b 环出异源双链技术(Heteroduples of loops) 未配对的多个碱基或环未知或已知的缺失或插入琼脂糖或丙烯胺 Nagamine等1989年异源双链UHG(Hete-roduplex UHG) 多个错配碱基或人为引入的多个错配碱基已知的单碱基改变丙烯酰胺 Wood等1993年a 原理　　和SSCA法一样，HA的理论基础也不多，一条DNA异源双链除了单个碱基错配外其余碱基对配对正常，它和另一条没有错配的同源双链具有不同的结构。这是由于，具有异源双链的DNA骨架会出现突起从而错配的碱基可能会旋入DNA双螺的旋沟槽中，或者旋到螺旋的外部，要不，DNA双链可能会在异源双链处发生曲折（bend）（见Ganguly等1993年的讨论）。因此，在非变性凝胶中电泳时，具有错配的双链要比没有错的双链移动得慢，从而将突变检出。因为有两种互补的异源双链，因此，就有两种机会检出某一突变。原理如图１所示。显然，如果要分析的等位基因不是杂合状态，那么纯合的突变等位基因就要与野生型的纯合基因相混合以便在检测分析之前形成异源双链。该方法的发展经过　　与SSCA方法类似，该方法最初被认为人为赝象，既对一段具有18bp缺失的600bpDNA杂合子用PCR方法扩增后，再用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，二者都显示电泳条带有异常的分离（aberrant）（Nagamine等1989年）。（这是基于PCR异源双链方法的最初例征）。分离的条带在聚丙烯酰胺凝胶中分得更开，而且显示两种同源双链彼此分开了（可能由此产生了双链构象多态法）而且将两种互补异源双链与同源双源也远远地分开了。但此方法自从其发明时起几乎未经发展，有关的主要论文如表２所示。表２　异源双链法的发展经过 1989年异源双链中的18bp碱基缺失造成PCR赝象 Nagamine等1989年 1991年用hydrolink凝胶检测点突变 Keen等1991年a,b 1992年用聚丙烯酰胺凝胶结合放射性标记检测突变 White等1992年　证明HA和SSCA法可以互相补充在同一块凝胶上进行异源双链分析和SSCA White等1992年 Spritz等1992年　　 Upadhyaya等1992年本方法的不同形式　　本方法的形式不很多样，反映了这种方法的简便性和作为方法的常规性。其中，基本变化是凝胶基质以用于不同片段DNA的分离。这些凝胶通常为实验灌注的聚丙烯酰胺，但，比较合适的凝胶如Hydrolink D500凝胶，一种丙烯酰胺衍生物和Hydrolink MDE凝胶（突变检测增强凝胶），二者可购自AT Biochem公司（美国）以及瑞典Pharmacia公司的Phast预备丙烯酰胺凝胶。　　还不清楚这些凝胶哪种效果最好，但 Soto 和Sukumar（1992年）提出hydrolink MDE 要比hydrlink D500和PAGE具有较高的分辩率和可重复性。实际上用hykrolink MDE可将野生型和突变异源双链分开。Ganguly等（1993年）报导对溶剂进行了广泛研究，以最大可能地提高检出比率。通过对温度和变性溶剂范围的检查，他们建议使用含有10%乙二醇，15%甲酰胺的Tris/牛磺酸缓液的6% 聚丙烯酰胺凝胶。这项技术称作构象敏感凝胶电泳（Conformation sensitive gel electrophoresis, CSGE）。White等人（1992年）证明10%的尿素对检测分析可能会有所裨益。　　额外加入对照DNA分子（Control DNA）以确保在样品为纯合子的情况下可以形成异源双链（Boyd等1993年），以及通过混合样品以确定等位基因是否相关（Wilkin等1993年）都是对原有方法的很好改进。通用异源双链诱发物（The universal heteroduplex generator　　如上所述，具有插入/缺失或多个邻近错配的异源双链要比含有单个碱基错配的异源双链容易分离。在早期的研究工作中，HLA-DR位点大样多态性的确定就是利用了上述事实。基于特定等位基因型异源双链间迁移率差异而设计了一个简便的同种异型鉴定体系（Bidwell 和Hui1990年； Sorrentino等1991年）。随后，通过构建一个在所要检测突变位点附近碱基有改变的探针而设计了一个方案以有意识地提高单碱基错配的检出范围。包括用于和检测DNA进行杂交的野生型分子缺失和碱基取代。这一策略的结果使与UHG链形成的异源双链的迁移率和与野生型链形成的异源双链的迁移率差异加大，从而使突变检出率增加（见图２）　　van den Akker等人（1992）首次介绍了该方法并在许多主要位点制造了单碱基缺失。运用这一体系，phast凝胶分离，银染可以检测出所有11种研究过的突变。在镰形细胞贫血突变检测中报道了类似的研究成果，并将这种野生型碱基替代的“探针”称作“通用异源双链诱发物”（Wood等1993年a）。在此例中，镰形细胞贫血突变5 ’ 端在UHG中，有4bp缺失，用聚丙烯酰胺小型凝胶（minigel）结合溴化乙锭染色法进行检查分析。他们认为此方法无放射性、结果明确、简便，可在一天内完成检测工作，比其他以PCR为基础的检测经济。然而，这种检测少不了电泳这一步。　　还是同一实验室推出了检测PKU（外显子12）（Wood等1993年 b）、β-地中海贫血（Savage等1995年）以及von Willebrand氏（遗传性假血友病）2B型（Wood等1995年a）等方法。在检测PKU一例中使用了一种UHG，其在外显子12上与野生型分子5个部位及所检测突变的5 ’ 端附近不同。理论上讲，这一方法仅使用了一种寡核者酸所以比较经济。在β-地中海贫血一例中，曾使用3种UHG来检查新加坡的人群状况。这使得作者能够在该地区检测出5种常见突变和11种罕见突变，而这些突变占这一地区等位基因的95%。后面这11种突变并不是设计UHG当初预计所要检测的，所以该方法的一个优点就是它可以发现潜在的未知突变。　　在该例中，只需3个长的寡核苷酸而其他以PCR为基础的诊断方法则至少需要一组16对寡核苷酸。这个实验室最近对确定Hbs 和C（补体）基因型的条件已进行了优化（Wood等1995年b）　　Zimmerman等人（1993年）用此方法区分DQA1和DQB1等位基因。他们所使用的3个探针实际上是天然等位基因而非人工序列。应用他们所称的“直接异源双链分析”法，以3个探针完成了通常需要用23个 ASO/SSO探针才可完成的工作。D ’ Amato 和Sorrentino（1995年）对上述探针进行了修改，在所分析的突变位点附近引入了3个碱基。　　这一方法已被用来分析组织的克隆性（clonality），依据是X染色体失活的类型（Doherty等1995年），从而可作为限制性酶法分析的另一替代途经。早期，Bristol研究小组和其他一些对各种疾病感兴趣的研究小组合作将其用于几种疾病的检测分析工作，但诊断界是否会采纳这个方法还要拭目以待。还不清楚，有目地构建一个“筛查用UHG（scanning UHG）”到底可以在一序列中检测出多少比例的未知突变，这是以后所面临的一大问题。同时，已很清楚，电泳对于该方法必不可少，相比之下，其他以PCR为基础的诊断方法可以不用电泳，所以这个方法不得不与后面的这些方法进行竞争。但，显然该方法是一种“低技术含量（low-tech ）”的非放射性方法，适于具有小型设备的实验室使用。实验检出率　　广泛的研究工作还很少但已做的研究见表3。可见，通常该方法的检出率在80-100%之间，但这可以通过检测条件的优化而予以提高，不过迄今为止，这种提高很有限。但最近有项研究报道（Peeters和 Kotze 1994年）将交链度从5%降至1%可以提高检出率。　　已发现的影响突变检出率的因素甚少，包括凝胶基质、凝胶的温度和变性剂，突变在待检片段中的位置以及突变所在片段的解链温度等。表3　异源双链法单碱基突变的检出率基因所研究的突变数检出的突变数参考文献抗凝血酶基因 8 6*（75%） Perry和Carrel 1992年人工基因 9 8（89%） White等1992年多种基因 68 65+（96%） Ganguly等1993年 HRRT 10 9（90%） Boyd等1993年 FIX 41 41（100%） Chen等1995年 *需要延长电泳时间　　+为获得这些数据对检测条件进行广泛优化，5个漏检的突变未计，因为其在双链端部附近（50bp以内）。　　Ganguly等人（1993年）发现，在所检测的共68个突变中，在双链端部50bp以内的5个突变被漏检了，这可以解释凝胶中高温解链区域的3个突变也被漏检了。　　奇怪的是，尚未详细研究片段大小对检出率的影响。多数研究只是检查了193-800bp之间的片段，但有一项研究（Boyd等1993年）对433-1533bp间的片段进行了检查，其包括1059和1278bp片段中的单碱基错配。他们认为该方法的检出上限在1300-1500bp间，不过还要有进一步的数据作支持。但，另一项研究证明，经过长时间电泳后，1433bp片段中的两个单碱基改变之一被检测出来了（Perry 和Carell 1992年）。　　Chen等(1995年)注意到,另一项用DGGE进行的研究中4个阴性突变可用HA检测出来。目前尚无假阳性结果报道，但有人建议PCR后不要再去进行另外的异源双源链操作。灵敏度　　有关突变检出比率的正式材料可以得到的很少。突变和“邻近序列效应”（Context effects）　　有关突变和邻近序列效应的研究工作很少。但White等1994年发现，具有同样错配碱基的异源双链分子和野生型分子相比迁移率截然不同。有人认为，错配碱基在周围碱基上的堆积效应或错配碱基两边碱基配对结合力量的强弱可能会影响“泡状结构”的大小，由此而影响了分离效果。如上所述，Ganguly等人（1993年）发现，高温解链区（high melting areas ）内的一些罕见错配碱基即使在最佳条件进行检测也无法检出。本方法的优缺点　　尽管此方法尚须进行深入研究，但其优缺点与SSCA法相似，见表４表４　异源双链分析法之优缺点优点：简便，步骤少无复杂的理论无特殊设备突变条带与野生型条带分离后易于进行其它分析有无需标记方法可供使用结合 SSCA 技术可以检出近 100% 突变缺点：突变的位置未知分析的片段大小可能受限依赖于实验条件可能会漏检突变较少用于序列未知的 DNA 如要检测杂合子必需先形成异源双链分子电泳结果可能会难以解释（图３）该方法的发展前景　　需要做的与此方法相关的最重要的研究工作是片段长度对突变检出率的影响，正如 Boyd 等人（ 1993 ）所指出的那样， 1kb 以上的样品可能会被检出。　　考虑到这个方法有许多理论基础，所以也许有多种可能性去实现 100% 的检出率。这是因为错配碱基可以形成泡状结构或曲折以此而影响双链的性质。如果电泳过程可以理想化地看作或等同于线状分子在细管中的移动，那么不管线性分子有多长，泡状结构或曲折都会阻碍其移动，从而可以解释 Boyd 等人（ 1993 ）的研究结果，所以用该方法也可能去分析长的片段。过去，交联度在 2-5% 间，凝胶浓度在 4-12% 间，这些条件都需要进行优化。 Hydrolink MDE 凝胶还未进行充分测试，但已清楚，无论如何这些现行的技术需还要进行改进。有可能找到一些合适的条件检出高温解链区中的突变。因为该方法依赖于电泳，所以电泳一步必不可少。主要应用　　缺失突变比单碱基改变易于检测（ White 等 1992 年； Boyd 等 1993 年），因此具有高比例小规模缺失的疾病最适于用此方法进行检测。已如前述，与 SSCA 法结合使用时检测能力很强。十个主要的应用如表 5 所示。因为 SSCA 法在此类方法中占有主要地位，所以 HA 法的应用数量比较有限，但，最近已将此方法用于突变筛查（ mutation scanning ）以及人类和病毒 DNA 变异性的研究上。表5 异源双链分析法的十个主要应用基因应用类型凝胶基质 / 染色方法参考文献 HLA 指纹法，骨髓供者 PAGE/E Clay 等 1991 视紫红质基因突变筛查 Hydrolink D5000,E Inglehear 等 1992 KIT 结合 SSCA 进行突变筛查 Hydrolink D5000,A Spritz 等 1992 NFI 突变筛查多个缺失 Hydrolink D5000,E Shen 等 1993 ATIA 突变筛查 Hydrolink ,E Chowchury 等 1993 HIV ENV 遗传关系 PAGE,E Delwart 等 1993 COL 2A1 VNTR等位基因的异质性 PAGE,E Wilkin 等 1993 COL 7A1 突变筛查多个缺失 Hydrolink MDE,E Christiano 等 1994 APC 突变筛查多个缺失 DAGE,A Mandl 等 1994 T 细胞受体γ T 细胞克隆性检测 PAGE,E Bottaro 等 1994 E：溴化乙锭染色 A：银染　　现已对非标记 DNA 法进行了大量的研究，这与 SSCA 法不同。不过，放射性物质标记法可能会有较好的分辨率。近来，聚丙烯酰胺凝胶要比 hydrolik 凝胶使用更为广泛。图４显示检测缺失突变要比检测单碱基突变来得容易。有人报道通过多重异源双链分析可以快速确定 DMD 携带者的单元型（ haplotype ） (Prior 等 1995) 。简要操作步骤　　此处给出的操作步骤取自发明该方法的实验室之一，他们完成了视紫红质基因（ Rhodopsin gene ）突变的检查工作（ Inglehearn等 1991,1992）。此操作主要适于检测单碱基突变。1 ． PCR 待研究片段。2 ． 94 ℃加热2.5分钟，0℃2分钟然后60℃下1小时，以形成异源双链。3 ．加 7-3 ц l 标准上样染液。4 ．按产品说明（ AT Biochem ）用 24cm 1mm 厚 hydrolink D5000 凝胶于室温电泳 1600-2000 伏时（ Vh ）。5 ．用溴化乙锭染色。操作步骤参考文献1 ． Borresen 1994 年。详细解释了如何用 hydrolink 或聚丙烯酰胺凝胶实现该分析。2 ．该方法比较简便，可在给出的文献中找到相应的指导。但，检测单碱基突变对实验要求较高。增加变性剂可能会提高分辨率，这清楚地证明了开始任何一项新的研究时，在 Tris/ 牛磺酸 /EDTA 缓冲液中加入 10% 尿素（见 White 等 1992 年）或 10% 乙醇， 15% 甲酰胺（见 Ganguly 等 1993 ）将是有好处的。实验设计时，要筛查的 DNA 应从端部 50bp 碱基以内开始（ Ganguly 等 1993 年）。
< 1 > < 2 >

设为首页 | 加入收藏 | 广告服务 | 友情链接 | 版权申明