单链构象分析（SSCA）

Orita 等 1989 年 a 　应用 PCR 扩增样品进行分析 Orita 等 1989 年 b 1991 年使用无标记分析，银染法 Mohabeer 等 1991 年　　 Dockhorn Dwornickzak 等 1991 年 1992 年使用无标记分析，溴化乙锭染色 Yap McGee 等 1992 年 1992 年事先用限制性酶切以增加筛查片段长度 Iwahana 等 1992 年　　 Lee 等 1992 年　本方法的不同形式　　除了表 1 所示的那些方法外，另外一些方法主要是提高一次分析中突变的检出率，还有些方法是针对分析操作形式而言的。(a) 提高突变检出率　　RNA 比 DNA 易于形成短的发夹折叠，而且 RNA2’ 羟基可以和别的物质结合，所能形成较多的构象形式。有两篇论文报道说用 RNA 易于检测突变。 Danenberg 等人（ 1992 年）只证明用 DNA 没有检出的两个突变用 RNA 都得到了检测，然而 Sarker 等人（ 1992 年）的研究更具说服力。例如，他们检查了 307bp 片段中的 22 个突变，结果发现，五种条件下的突变检出率仅有一例没有因为使用 RNA 分析而提高。每次实验的突变检出率（ % ）如下（ SSCA ， RNA SSCP ）： 59 ,95; 64,64 ; 59,86; 50,55 。虽然突变检出率得到了提高，但由于需要制备 RNA ，所以这一优点也就被抵消了，这就是为何这一方法不太被人被使用原因。　　为了提高突变检出率，同时也发展了双脱氧指纹技术（ dideoxy figerprint,ddF ） (Sarkar 等 1992 年 b) 。象测序一样，用双脱氧核苷酸同末端标记的 DNA 链反应，之后用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后进行放射自影得到“指纹图谱”，从而可以显示出正常分子与所有或部分突变分子的差别，这使得对突变定位成为可能。由于突变所在序列具有多重性，所以 84 个突变全部被检测出来了，但发现了 4 例假阳性结果。尽管此方法比 SSCA 法有其明显的优点，有 100% 的突变检出率，只不过尚未广泛应用，这可能是因为 ddF 法使用了放射性物质，需要对 DNA 分子进行标记，而且还要进行序列分析。然而，最近有人介绍了荧法，指出无需制备标有染料的引物，并对荧光 SSCP 法和荧光 ddF 法优缺点进行了讨论。另外，已对一个突变进行精确定位（ Ellison 等 1994 年），随后用上述方法对 p53 进行了研究（ Blaszyk 等 1995 年）。　　由于突变检测模式不同，所以用 SSCA 法和异源双链法分析同一样品时，都可以检出突变（见下文），因为两种分析方法可以在同一张凝胶上进行，所以十分方便（ Spritz 等 1992 年）。 (b) 不同的分析方法　　已有人用荧光引物结合自动测序仪对样品进行多重扩增后将营养不良基因的多个外显子在同一电泳道上电泳进行了分析（ Saad 等 1993 年）（图 2）。近来对自动化测序仪有所发展，使用温度控制装置有望提高分析精度，也许还可以提高突变检出率（ M. Galvin ，私人交流获悉）。 Iwahana 等（ 1994 年）用两种荧光物质标记两条互补链以提检测分析的灵敏度。还有人使用甲酰胺堆积凝胶对样品进行变性，以防止加热时引起沸腾同时也可以防止重退火（re-annealing ） (Yap 和 McGee 1993 年 ) 。为了提高一次分析所能筛查的片段长度有人使用了双向（ two-dimentional）凝胶电泳（ Kovar 等 1991 年）。在这个方法中，用常用的切割酶将 DNA 切割后用变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳分别在两个方向上按分子大小将各片段分开。为了提高检测速度，经一致努力（ Wittall 等 1995 年）发明了一种每 24 小时可以检查大约 1000 个片段的新方法，它使用预先制好的凝胶进行分析，该方法一经推出很快就被普遍使用了（ Dockhorn-Dwornickzak 等 1991 年； Mohabeer 等 1991 年）。另外，关于 MDE （突变检测增强）凝胶已有多篇文献（ AT Biochem 1991 年分析 DNA 折叠的程序（ folding programes ）。 Nielson 等（ 1995 年）最近推出了一种折叠分析程序，该程度可为特定序列选择最佳引物。突变检出率　　SSCA 法的突变检出率可能最使人灰心，因为，通常情况下一种条件（ 100-200bp 大的片段）仅可检出 50-95% 突变，只有应用 3 种或 3 种以上条件才可使突变检出率达到 100% 。现在还无法预测突变检出率和检测条件。然而该方法的发明人之一 K. Hayashi 声称可以找到检测条件将含有突变的片段与野生型片段分开。如果真的如此，那么该方法在诊断上将会很有用处，因为要诊断的突变都是已知的。　　有几项研究指出了突变检率的问题，即它有赖于检测条件和检测分子的长短。这些研究表明对于 100-300bp 片段检出率从 35% 到 100% ，这可能是邻近序列效应（ context effects ）的缘故或对检测条件的选择有一定的偶然性。　　已有一篇综述讨论了 SSCA 突变检出率（ Hayashi 和 Yandell 1993 年），另有四篇综述详细地分析了影响突变检出率的因素（即 Sarkar 等 1992 年 a ； Sheffield 等 1993 年； Glavac 和 Dean 1993 年； Ravnik-Glavac 等 1994 年）。　　Hayashi 和 Yandell （ 1993 年）认为，对于 200bp 以下的片段 90% 以上的突变可被检出，而对于 300-350bp 片段一种条件可以检出 80% 以上的突变。他认为影响分离非常相近片段最主要因素是温度、盐浓度、甘油、过载（ overloading ）、片段长度、多重 PCR 的条件及凝胶基质。所以建议在室温 5-10% 甘油或 4 ℃无甘油的情况下进行电泳。　　片段大小。已发现所分析的片段大小是决定突变检出率最重要的因素，这可从图 2 中看出，该图系将 Sheffield 等人（ 1993 年）对 3 个基因 64 个突变的研究结果复合而成的。图中显示最佳片段大小为 155bp 。应用单个条件对 212bp 或 212bp 以下 DNA 片段进行分析平均突变检出率是 79% 。然而，再使用第二个条件，对所检测的区域来讲，仅使检出率提高了一点。另一项研究（ Glavac 和 Dean1993 年）详细检查了小鼠β血红蛋白基因 193bp DNA 中的 86 个突变，只不过着眼的因素不同（如图 2 ）。　　凝胶的孔径 / 交联度。能找到 2 个条件使所有突变与野重生型分子分开，这便是用 5% 或 7.5% 的丙烯酰胺（ 2.6% 交联度）于 4 ℃电泳。已发现温度是一个重要的影响因素。之后在一篇研究 CFTR 基因论文中， Ravnik-Glavac 等人（ 1994 年）再次发现交联度很重要， 10% 凝胶 1.3% 交联度最好。像甘油这样的中性化合物可以改变分离效果，而像尿素这样的变性剂则可使分辩力降低。还发现，突变邻近碱基序列要比碱基改变的类型重要得多，而且再次声明片段大小十分重要，很有趣味的是富含嘌呤的链显示了更强的可变性，对突变最敏感。　　碱基组成。 Ravnik-Glavac 等人（ 1994 年）应用 10 种已测条件详细地筛查了 CFTR 基因 27 个外显子中的 134 个突变，发现了碱组成可用来预先决定凝胶的最佳构成。对高 G+C 含量的片段，凝胶中使用蔗糖要比甘油好。他们还发现在一个单独条件下（见下文）能够检测出 98% 的突变，即在 29 片检测片段中仅有 4 个突变被漏检。商业出售的水合（ hydrolink ）突变检测增强（ MDE ）凝胶（ AT Biochem ）尽管有 95% 这样高的检出率，但它却显示了大量的异源双链分子从而阻碍了突变的检测。　表 2 DNA SSCP和 RNA SSCP的突变检出率（ %），数据来自 Sarkar等（ 1992年 a）　所研究的突变数 DNA SSCP 检出率 RNA SSCP 检出率 183bp 12 83 93 307bp 22 58 77 520bp - 少数少数 F IX 突变 20 35 70 　　Sarkar 等人（ 1992 年 a ）在文章中不仅注意到 SSCA 的检出率，而且还注意到 RNA SSCA 技术可使突变检出率提高（表 2 ）。因子 IX 突变的检出率看来很低，但还不清楚到底是检测条件的问题还是邻近序列的影响。然而，可以清楚看到 RNA SSCA 检出率要高于 DNA SSCA 。　　用鼠β血红蛋白启动子突变， Ellison 等人（ 1994 年）研究了荧光标记碱基双脱氧指纹技术的突变检出率；结果 33 个突变都被检测出来了。　　应用 ddF 技术，最近已有人（ Liu 和 Sommer1994 年）深入研究了影响 ddF 和 SSCP 灵敏度的因素。利用因子 IX （ factor IX ）基因 84 个单碱基改变检查了凝胶基质、温度、片段大小、甘油、引物所产生的影响。发现 Gene Amp 和 MDE 凝胶要优于聚丙烯酰胺凝胶， 8 ℃电泳比 23 ℃好。 8 ℃时使用 Gene Amp 凝胶， ddF 法检测出了全部 84 例突变。并再次发现序列大小和突变位点邻近序列也是影响因素。现在来看检测速度， SSCP （一种条件）约是 ddF 的 3 倍，可是 ddF 的灵敏度总是较前者高。　　Vidal-Puig 和 Moller （ 1994 年）用一组 19 个已知突变检测了 3 种常用的 SSCP 方法。在一种条件下，用合适的 phast 凝胶检出了 95% 的突变。在有和没有甘油（ 10% ）情况下，检查了倾注凝胶（聚丙烯酰胺凝胶和 MDE 凝胶）的检出率。结果没有甘油的凝胶检出率分别是 89% 和 79% ，而含有甘油的凝胶检出率分别是 68% 和 63% 。然而，如果同时用含有甘油和不含甘油的两块凝胶进行检测，那么两块凝胶可以检测到所有的突变。　　基他一些基因突变的检出率给于表 3 中。应该注意高的检出率，特别要注意的是因子 IX 基因，因为在 Sarkar 等人的研究中（ 1992a ）其检出率较低，不过这也许是由于检测条件得到了优化，研究工作并不是盲目的缘故。表 3 SSCA 的一些突变检出率 DNA 条件个数突变数检到的突变参考文献小鼠 - β血红蛋白基因 1 48 46 （ 96% ） Ellison 等 1993 OAT 3 20 20 （ 100% ） Michaud 等 1992 蛋白脂质蛋白基因（ Proteolipid protein ） 1 12 11 （ 92% ） Doll 等 1992 因子Ⅷ 1 23 - （ 70% ） Economou 等 1992 因子 IX 1 25 24 （ 96% ） Poon 等 1993 因子 IX 1 17 16 （ 94% ） Lin 和 Shen1993 CFTR 5 （ -10 ） 134 134 （ 100% ） Pavnik-Glavac 等 1994 　　Leren等人（ 1993年）用 4个条件进行检测分析推测将会检测出 100%的突变，结果表明，单个条件下突变检出率从 77%到 87%，从而强调要用多个条件进行检测分析。　　最近有文章详细分析了限制性酶法（限制性酶指纹分析技术）及检测突变的效果（Liu 和Sommer1995年）。这项研究从因子IX基因的1bp片段筛查出24个点突变。它用5组限制性酶（共8个酶）分别对该片段的几等份样品进行消化，以保证片段大小平均在150bp。然后将消化后产物混合，对5’端进行标记，变性，再在非变性条件下电泳。因此，每个道都筛查这1kb片段样品，且都包含68个片段。用丙烯酰胺凝胶和Gene Amp凝胶于23℃或8℃进行电泳。由某一酶限制性位点的有无检测到了21%突变。丙烯酰胺凝胶在23℃检出了96%的突变，而Gene Amp凝胶在23℃或8℃时检出率是100%。后面这些数据通过盲法实验得到了证实，这个分析的实例可见图4。　　因此，尽管大量的限制性内切酶的使用使电泳图谱很复杂，但对1kb长的片段来说，这个方法可以保证近乎100%的检出率，然而这样却不简便了。总之，如果要分析外显子大小的片段，只有选择多个电泳条件才可以保证100%的检出率。另外，通过将核技术与异源双链技术相结合，可能会使突变检出率有所提高（见下文）。这一方法很少有假阳性结果报道（Knowles Williamson1993年）。灵敏度　　少量突变分子与野生型分子的混合物中突变分子被检出的百分比估计在3%和5%间（Hongyo等993年，Neri等1993年分别报道）。突变和邻近序列效应（corctext effects）　　Sheffield等人（1993年）是最早研究突变及邻近序列影响的人之一。他们的研究也显示突变所在片段的性质及突变所处的位置均对检测有影响。这意味着用引物扩增的片段或用限制性酶切得到的片段进行分析都可以提高突变检出率。通过对突变类型分析后发现，转换和巅换间存在巨大的差异。但在特定实验中G到T转换的突变检出率为57%，相比之下，其他类型突变的检出率为79%。同一位点不同类型的序列改变对实验结果影响很小，所以本方法尚不能区分这种情况。本方法的优缺点　　SSCA法的优缺点列于表4。现行的SSCA方法按检出率依次增加的次序总结于表5。表4 SSCA法的优缺点优点简便，步骤少无复杂的理论无需特殊设备突变条带与野生型分开后可用于分析有不用标记的测定方法缺点突变位置未知分析片段的大小受限强烈依赖实验条件之选择可能会漏检突变序列未知DN-段无法使用电泳结果难于解释（图5）表5 SSCA法检测的策略无放射性法 1个检测条件随机选择 MDE凝胶 1个检测外显子的条件经过优化优化条件加上异源双链技术 2个来自突变多重检测的条件（Glavic 和Dean 1993年） 4个检测条件随机选择双脱氧指纹技术限制性核酸内切酶指纹技术 ABI测序仪　　发展前景　　很难见到对于任意DN-段该方法可以保证有100%的检出率，但如果在多个条件下进行分析，还是可以接近100%的，不过，这将无疑使该方法失去了简便性，并使花费增大。既然如此，该方法就不大可能被选作诊断方作，但却可能经常用于某些实验，象研究检测多态性等可忍受80-90%检出率的实验。　　显然要没有电泳就不可能有这个方法，尽管检测速度严重地受限于这一步。　主要应用　　近几年该方法主要应用于以下三个方面：筛查基因组DNA，筛查cDNA以及筛查有用的DNA多态。表6给出了这几类应用的一些指导性实例。很有意味的是，所有这些例子都应用了放射性物质，而没有使用非标记方法，尽管后者自1991年后已有现成方法可用，而且其优越之处明显受人推崇。这其中的原因推测是放射性物质标记法对少量DNA样品仍有较好的检测灵敏度。表6 SSCA法十个主要应用，其他应用实例见上文基因样品数应用类型条件数参考文献 p53 106 两个片段外显子2-11 含5个突变，对外显子2，4，10，消化 2R Toguchida等1992年小鼠基因　检测多态性 1R Beier 等1992年肌原纤维蛋白基因 20 6034bp cDNA用7个限制性核酸内切酶切成9段 2R Kainulainen等1993年胶原αI（I）基因 25 4000bp cDNA，4个PCR扩增片段，每个片段用限制性核酸内切酶消化4-5次（共有13个限制性酶）几个R Mackay等1993年 CFTR基因 137 27个外显子 1R Claustres 等1993年 APOB基因 21 外显子26，745bp，6个PCR扩增片段，每个片段2个限制性位点 3R Ilmonen等1994年 WT1基因 98 10个外显子，21个段 1R Varanasi等1994年 Ryanodine受体基因 30 15,500bp cDNA约50个片段 3R Quane等1994年 RB1基因 24 27个外显子，17个经消化（得到49个片段） 2R Shimizu等1994年营养不良基因 70 16个外显子，多重扩增 1 Kneppers等1995年使用放射性物质　　(a) 外显子的筛查。由于片段大小关系，外显子最适于用SSCA分析，但是仍有些外显子太大无法进行分析，因此，就使用了限制性核酸内切酶（例如对p53基因的研究，Toguchida等1992年）；APOB基因外显子26的研究，Ilmonen等（1994年）。因为通常等位基因剂量是相等的，而且外显子适于用SSCA法分析，所以对外显子筛查就十分可行，从而也就使这一方法被广泛使用了好些时候了。但迄今所发表的论文都是研究性的而不是诊断性的。这说明，此处列出的策略很耗时费资。例如在RB1基因的筛查中（Shimizu等1994年），要检查一名患者的基因组就必需对27个外显子进行扩增，其中17个外显子在事前还得进行消化然后才能在2个条件下进行检测分析。因此，工作量很大，得用52条凝胶电泳道电泳。　　(b) cDNA筛查。通常进行cDNA筛查的目的是为了省去某些工作，而这些工作对单个外显子检测是必需的（除此之外还可更容易地显示剪切位点的突变）。从Kainulainen的研究工作（1992年）可以看到用这一方法分析时的典型办法（图6）。此例中，6034bp cDNA扩增成9个重叠片段，其中7个用合适的限制性核酸内切酶消化以使形成的片段更易于进行SSCA分析。然后将这9个样品在两种SSCA条件下电泳。比较长的4000bp胶原αI（I）基因扩增成4个片段，每个片段用13种限制性核酸内切酶中的4-5种结合进行消化，然后，在多种条件下，对17个样品进行必要的分析。对15,500bp的Ryanodine受体cDNA进行检测分析是一项艰巨的任务，要进行大量的工作。大约制备了50个PCR扩增片段，每个片段在3种条件下电泳，所以对每个患者必需150个道的凝胶电泳，这样整项研究大概需要做4500个道！a 多态性检测这种检测每次只用一种条件，这说明了本方法无需检出所有的突变。简要操作步骤　　与DGGE分析方法不同，因为DGGE法有其理论基础，而对于SSCA法，没有现成的理论可以预测单链DNA分子在给定条件下其在溶液中的构象。对SSCA分析条件的优化选择是凭经验行事的，这应该通过变换主要分析条件（如DN-段长度、温度等）而对特定片段的测定来进行。　　这里所给出的操作方法取自一个在p53基因研究方面很有经验的实验室，该方法主要用来检测p53基因（Toguchida 等1992年，Kypryjanczyk等1993年），但是正如上文所讲，正式检测时（Serious application）对已知突变而言，这些检测条件应该确定下来。 1．PCR扩增目的片段DNA， 2．将样品的1/10（约5μl）稀释于15-40μl 0.1%SDS，10mM EDTA溶液， 3．按1:1将上述溶液与98%甲酰胺、89mM Tris、2mM EDTA、89mM甲酸、0.05%溴酚兰、0.05%二甲苯青上样液混合， 4．95℃热变性2分钟， 5．上样（a）6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，（b）6%非变性聚丙烯酰胺凝胶加10%甘油， 6. 在室温（ambient temperature）电泳，8W 8-16小时 7. 放射自显影简要操作步骤的参考文献 1.Warren等1994年。详细解释了该方法的操作过程 2.Fujita和Silver 1994年。进一步详细说明了如何实施该方法 3．这个方法很简单，可在本章所给出的参考文献中找到很多方法介绍。然而，Ravnik-Glavac等人（1994年）广泛地研究了CF基因的外显子，阐明了一种灵敏度很高的凝胶分析条件（一种条件）很值一试。该条件是，10%丙烯酰胺，1.3%交联度，10%甘油，4℃，50W电泳10-16小时，缓冲液用50mM Tris硼酸缓冲液。
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