蛋白质印迹免疫分析（Western Blot Anglysis）

3.3-diaminobenzidine，3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml，0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10μl（临用时现配）。 9．脱色液：甲醇250ml，冰醋酸100ml，加蒸馏水至1000ml。 10．氨基黑染色液（0.1%氨基黑-10B）：0.2g氨基黑-10B溶于200ml脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸过滤。【操作步骤】（一）转移印迹 1．转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏水中10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min 。 2．凝胶平衡：将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移buffer 中平衡30-60min。 3．按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。 4．开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流0.8mA/cm，室温下转移1h，转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ，然后脱色检测转移效果。（二）免疫染色 1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2．TBS洗膜1-2次，10min/次。 3．加HRP标记的抗体，室温1h 。 4．TBS洗3次，10min/次。 5．NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。
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