DNA序列如何测定

链DNA分于分成4份，每份用一种化学试剂处理DN-段，每种试剂可使DNA分子在一种碱基的5’端的磷酸二酯键处发生断裂。例如，试剂一可使单链DNA分子在A碱基处断裂，试剂二可使单链DNA分子在T碱基处断裂，依此类推。把反应条件控制好，使每个DNA分子只发生一次断裂，这样，我们就得到4种反应产物，每种由在一种碱基处发生断裂形成的DN-段组成。把这4种反应产物用聚丙烯凝胶电泳进行分离，两个DN-段只要相差1个碱基，就可以在这种凝胶中被分成两个条带。电泳完成后，用X光胶片进行曝光，最后得到一张由不同条带组成的序列图。从这张图上就可以读出待测DN-段的碱基序列。5’端的第一个碱基G读不出来，可以通过测定互补链的序列测出这个碱基。三、酸法测序与测序的自动化另外一种得到长度只差一个碱基的DNA分子的方法是英国科学家桑格发明的，这种方法利用DNA聚合酶以待测序的DNA单链分子为模版合成互补的新链。在合成新链时，合成原料除了4种脱氧核糖核苷酸外还加入一种2’和3’位上的羟基都脱除的核苷酸。由于缺少3’羟基，当这种核苷酸被结合到链上后，它的后面不能再结合其他核苷酸，链的合成就此终止。与化学法测序类似，我们可以准备4种反应物，加入的核苷酸类似物分别携带A，G，C，T碱基，每种反应物里包含在一种碱基处终止链延伸的长短不同的DN-段。这些DN-段也要用放射性标记，经过凝胶电泳和放射自显影，得到DNA条带图谱，根据图谱可以读出DNA的碱基序列。这种方法比化学法简单，条件易于控制。用4种不同的荧光化合物分别标记4种反应的产物，就可以做到把4种反应物混合在一起进行电泳，可以提高电泳分析的效率。这种方法利用现代精密仪器和机器人技术可以实现DNA测序的高度自动化。目前市场上已经有各种型号的DNA自动测序仪可供选购。根据最新计划，到2000年人类基因组的“草稿”要出来。这个“草稿”包含了90％的人类基因组的序列，每个区域测定5次左右。到2003年完整的人类基因组序列测定可以完成，这个序列可以作为“参考基因组”或者“标准基因组”用于生物医学研究。测定这个“标准基因组”所用的DNA是由10到20位志愿者提供的，用男性的精子DNA和女性的血液DNA作为样品构建了人的基因组文库，因此，“标准基因组”序列不是哪一个具体的人的序列，而是几十位志愿者的序列的综合体现。四、单分子荧光测序单分于荧光测序是一种快速DNA测序法，这是利用单分子操作技术直接读取DNA的碱基序列的方法，与传统的荧光测序法相比，这种方法可大大提高速度。用桑格测序方法现在每天可以解读上万个碱基序列，但是如果单分子荧光测序取得成功，它可以在两分钟内完成传统方法一天的工作。单分于荧光测序的主要过程如下。第一步，取一条大约有5万个碱基那么长的单链DNA分子，把它的一端用化学方法连接在一个非常微小的塑料球上，DNA分子就会缠绕在塑料球上。第二步，在一张类似激光唱片的圆盘上铺一层很薄的液体薄膜，然后用激光光钳把塑料球放在这张光盘的液体膜上进行移动，DNA分子就会在后面被拖着展开，就好像一只船拖着一条绳子快速前进，把绳子拉展一样。第三步，让拉展的的DNA分子与一种核酸外切酶结合。这种核酸外切酶可以和DNA的游离的末端结合，然后逐个把DNA的碱基切割下来。第四步，用单分子光谱技术逐个识别并且读出碱基即达到了测序的目的。目前，单分子荧光测序技术还没有完全成熟。主要问题是用于识别单个碱基的单分子光谱技术还没有过关。利用隧道扫描显微镜和原子力显微镜直接读取DNA分子碱基序列的研究也正在进行之中，近期内有可能取得突破。五、DNA芯片与杂交测序DNA芯片是一种通过杂交测定未知DNA序列的新技术。在一个玻璃或硅片上合成大量的寡聚核苷酸片段，例如可以合成8个碱基长的全部可能的寡聚核苷酸片段（4８＝65，536种）。这些探针一头固定在固体基质上，另外一端是游离的。它们在硅片上有规律地排列着，每个特定位置上探针的序列都是已知的。假如有一个DN-段需要测序，我们可以把它的单链形式用荧光进行标记，然后与硅片上的6万多种探针进行分子杂交，在荧光显微镜下观察杂交结果。如果某个探针与持测DNA的某个部分的序列是完全互补的，待测DNA分子就被结合到硅片上，这个探针所在的位置就会发出荧光。这种包含大量的生物遗传信息的寡聚核着酸阵列就叫DNA芯片，也叫基因芯片。DNA芯片的制备要利用微电子芯片生产中的光刻技术以及在位组合化学技术。DNA芯片的阅读要使用显微术，信息的解读要利用计算机技术。因此，DNA芯片是多学科交叉的产物。
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