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（>pH 8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）用其他二价离子替代镁离子（如Mn++，Cu++，Co++，Zn++等）(以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些。)抑制星号活性的方法：尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg++。
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