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子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条；这样都会造成2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。 核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。 样品制备程序：⒈培养细胞（culture cell）样品处理方法： 培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，本实验室主要采用如下成份：(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10. 其他常用的裂解缓冲液如下：(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10,1%(w/v) DTT and 5mM Pefabl℃ proteinase inhibitor;(C) 加入0.3 -1% SDS 在95 ℃ 煮样品5mins ，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。总蛋白抽提程序：（1） 培养细胞的收集；（2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000g， 各2min）；（3） 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS；（4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100µL 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；（5） 4℃，40,000g，离心1h；（6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃ 备用。组织样品处理方法：对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物树叶总蛋白程序：（1） 在液氮中研碎叶片；（2） 悬浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%ß-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20 ℃ 的冰浴；（3） 让蛋白质沉淀过夜然后离心（4℃，40,000g, 1h），弃上清；（4） 重悬沉淀浮于含0.07%β -巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；（5） 离心（4℃，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；（6） 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4℃，40,000g, 1h）。（7） Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78℃备用。超速离心法：（1）取材；（2）用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g 样品加入0.5ml 裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；（3）组织悬液15℃，10 000×g 离心10 min；（4）上清液4℃，150 000×g 超速离心45 min；（5）小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40,000g 再次离心50 min；（6）取离心上清。Bradford 法定量，分装后置–75℃保存。文献报道较多的裂解液配方Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final concentration Amount Urea (FW 60.06, Sigma, >99.5%) 9 M 10.8 g CHAPS (FW 614.89,Sigma, >98%) 4% (w/v) 0.8 g Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 µL/200 µL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml) Final concentration Amount Urea (FW 60.06) 8 M 9.6 g CHAPS 4% (w/v) 0.8 g Tris base (FW 121.1) Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃ A cocktail of protease inhibitors DTT (FW 154.25,Promega) 1% 13 µL/200 µL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final conc. Amount Urea 5 M 3.0 g Thiourea (FW 76.12) 2 M 1.52 g SB 3-10 (FW 307.5) 2% 0.2 g CHAPS 2% 0.2 g Ultrapure H2O to 10 ml A cocktail of protease inhibitors DTT (FW 154.25,Promega) 1% 13 µL/200 µL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃ Lysis buffer F100 µL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT,25% v/v glycerol注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。广谱蛋白酶抑制剂混合物（如加tris 可不用此混合物） 成分 终浓度 蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 µg/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 µg/ml 亮肽素 0.5 µg/ml 其中C-F 是分步法提取的4 种裂解液配方, C 适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F 适于提取难溶的沉淀蛋白。欲了解更详细的样品制备信息，可参考：http://us.expasy.org/ch2d/protocols/protocols.fm1.html.
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