蛋白质溶解的初始操作步骤

实验步骤l)准备细胞膜的粗提成分，在蛋自质浓度为10mg/ml的50mmol/L缓冲液中，加入0.15mol/L KCl,4℃保存;2)用同样的缓冲液配制去垢剂储存液(10%,w/v);3)分别在含0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%、3%去垢剂的缓冲液中稀释细胞膜的粗提物，使其浓度约为5mg/ml;4)4℃震摇1h(避免气泡产生;5)4℃ 100000*g离心1h;6)吸弃上清，加入同体积、同浓度的含去垢剂的缓冲液;7)每一步需测定蛋白质浓度;8}每一步需测定酶活性。一般规则1)最合适的使蛋白质溶解和保持蛋白质活性的去垢剂浓度可在后续的实验中继续使用。如果用不同的去垢剂均不能获得较好的结果，可探索将多种去垢剂混合使用。若蛋白的活性很低，可在溶液中加人20%~50% v/v的甘油保护。还需加人还原剂(1mmol/L DTT或5mmol/L二巯基乙醇)，鳌合剂(1mmol/L EDTA)或蛋白酶抑制剂(75ug/ml PMFS,20mg/ml Leupeption或pepstatin;)。2)有些时候，蛋白质如果在KCl溶液中不溶解，往往可溶于0.1~O.2mol/L的磷酸盐溶液中。3)蛋白的溶解一般发生在去垢剂的浓度达到CMC值时。4)1981年Bordier使用了非离子去垢剂Triton X-114在分离膜蛋白的第一步中(这一步可迅速的分离膜蛋白以避免溶酶体蛋
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