真核转染

磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、病毒载体，以及阳离子脂质体介导转染法。进行真核转染的一般程序：克隆目的基因（经测序验证）－准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定下面以pcDNA3为载体，p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。一、试剂准备1、HBS（Hepes-buffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,调pH到7.4,补ddH2O至100ml, pH7.4，滤过除菌。2、核酸贮存液，过滤除菌。3、培养基：含血清或不含血清的，用于转染细胞的正常培养。二、操作步骤（一）克隆目的基因1、根据GenBank检索的目的基因序列，设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，行RT-PCR。2、回收特异性扩增片段，连入T载体。3、转化DH5α，质粒制备。4、酶切初步鉴定，测序证实。（二）真核重组表达载体的构建：pcDNA3载体带有在大肠杆菌中复制的原核序列、便于挑选带重组质粒细菌的抗生素抗性基因，以及表达外源DNA序列所必需的所有真核表达组件。重组质粒与pcDNA3分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收插入片段和pcDNA3线性片段T4连接酶连接转化DH5α质粒制备BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。（三）重组pcDNA3转染SHG-44细胞：1、 G418筛选浓度测定：SHG-44培养于24孔培养板→G418 分别用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各浓度3复孔，设正常对照3复孔。以10-14天细胞全部死亡的浓度为筛选浓度，结果为200mg/L。2、在转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到60%-80%覆盖。一般要求，6孔培养皿（35mm），每孔1-2ml培养基3×105细胞。依据不同大小培养板调整每平方厘米的细胞数量。典型贴壁细胞平板密度培养板大小生长面积（cm2）大约细胞数培养基容积（ml）组织培养皿（φ60mm） 28 6.6*105 5-6 6孔培养板（φ35mm） 9.5 3*105 1-2 12孔培养板φ22.6mm） 4 1.3*105 0.5-1 24孔培养板（φ8mm） 0.5 0.6*105 0.25-0.5 3、 SHG-44细胞的转染：(1) 转染当天，加入脂质体/ DNA混合物之前的短时间内，更换1ml新鲜的有血清或无血清培养基。(2) 准备不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以确定每个细胞系的最佳比例。① 溶液A：用HBS稀释DNA（pcDNA3、重组pcDNA3）各1.5μg 到总体积50μl（30μg/ml）。②溶液B：用HBS稀释6μl脂质体到终容积50μl（120μg/ml）。③混合溶液A和B，轻柔混合（不要振荡），室温孵育15min，以便脂质体/DNA混合物形成。(3) 不要移去培养基，逐滴加入100μl 脂质体/DNA混合物（从培养孔一边到另一边），边加边轻摇培养板。(4) 37℃孵育6hr。(5) 6hr后更换转染培养基，加入2-3ml新鲜生长培养基。(6) 转染24hr后施加筛选压力，改用含G418的培养基培养。4、 G418筛选：在G418筛选浓度下持续培养14天后，挑出单克隆，扩大培养，同时转染pcDNA3即SHG-44-vect，并设对照组细胞即SHG-44。（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Westernblot）。（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。用于转染的核酸应高度纯化。为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
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