石蜡制片技术

一部位,其组织构造往往能够代表整个器官的基本情况,但不同部位,即便是同一器官,其组织构造,亦有一定的过渡差异,通常在选择材料时,要注意选择器官靠中间的部位作为试验材料,当然如果是作生长发育观察,则另当别论。因此选好试验材料，对于整个实验至关重要。 2 制片程序简介：当选择好材料后，实验的主要过程有以下步骤：固定或软化—>冲洗—>脱水—>透明—>浸蜡—>包埋—>切片—>贴片—>烘片—>脱蜡—>二重染色—>封片A)材料的固定或软化：最好用新鲜的固定材料（新鲜材料要迅速杀死植物细胞，最大程度保持组织和细胞的自然状态，这就是所说的杀死和固定）。干材料可先行软化（常用温水浸泡，勤换水，勿使材料腐烂）。一种固定液兼有杀死和固定双重作用，固定液能否迅速渗透于组织中，既与固定液本身的穿透能力有关，也因组织的致密程度有关，因此要根据材料的情况选择固定液，一般的固定液中，FAA固定液的作用较快（叶类材料至少4小时，或8－24小时、木类材料3天－一周），而含有铬酸的固定液作用较慢（叶类材料至少8小时，木类材料一周以上，期间最好更换一项固定液）。组织细胞的杀死和固定是同时发生的。所谓杀死是指在很短的时间内终止细胞的生命力；固定是指在杀死的同时，保存了组织细胞的构造基本上没有改变，其目的有一下几点：①防止组织细胞中细菌和酶的活动而引起霉烂。②减少组织细胞在以后程序中的收缩和变形。③植物细胞在生活状态下，有些结构模糊不清，经固定使各部分结构清晰可辨。④经过固定的材料，组织细胞容易着色。B)冲洗：若为固定的材料，制片前用流水冲洗直至固定液被彻底置换干净；水溶性固定液要用水洗，特别是含有铬酸的固定液应用流水冲洗；醇溶性固定液，应以固定液中酒精浓度相等或相近的酒精洗涤。流水冲洗时以慢速流水进行冲洗，切忌流速太快使材料上下翻飞而使材料损坏；用酒精混合固定液固定的材料，用同浓度的酒精溶液更换洗涤；固定液中含有苦味酸，无论它是水溶性还是酒精溶液，一定要用酒精溶液洗涤；含有铬酸或其它金属离子的材料可流水冲洗4－24小时，以彻底清除金属离子。C)脱水：经过冲洗或软化的材料，因组织内含有大量的水分，在以下的步骤中会有干扰，故须将水脱干净。通常预先配制好从10%—100%的梯度酒精溶液，在一定时间范围内逐级置换（注：梯度、时间要视材料的性质而定，不能一概而论），直至到达100%的酒精两次。（梯度酒精脱水时间可按材料的大小、质地情况而定，如较幼嫩的根及根茎、茎、叶等材料，在70％一下浓度的酒精，一般2小时更换一次，70％以上的酒精约在4小时以上更换一次。在一般情况下，材料应在70％酒精中过夜；坚硬的木质材料，每级度酒精需4－8小时；材料进入70％酒精以上时，每级度酒精要更换以－2次。）D)透明：因以下的步骤是使用脂溶性很强的石蜡，但以上最末步骤的纯酒精，亦不会与此相溶，因此本步骤的关键是选择一个界于二者之间的溶媒，以实现自然过渡。通常选择二甲苯与无水酒精配成梯度并在一定时间范围内逐级置换，直至达纯二甲苯两次。E)浸蜡：使组织细胞内浸入石蜡，以填充组织间隙和细胞内，是以下各步骤的关键所在。以上步骤所选择的二甲苯可以和石蜡相溶，因此将二者配置成不同的梯度，并在一定的时间范围内逐级更换（注：本步骤可在恒温箱中进行），直至纯石蜡两次。F)包埋：将材料与熔融的石蜡凝固在一起,叫包埋。这个过程要求动作要娴熟、快速、到位，通常所用的工具有镊子、酒精灯、包埋模具（金属或用纸自己折叠）、冷水等。在此过程中，要注意材料在蜡块中的位置，这与以后的各过程好坏有一定关系。G)切片：将包埋好的蜡块修理成梯形（中央有材料），再将蜡块熔粘在特制的木块上，然后固定在旋转切片机上进行切片。将切下的蜡片用镊子摆放在深色的纸上（靠刀口面朝下）。若蜡带不直，则要修正蜡块的几个边，使之规则后再切；若连不成带状，说明蜡质过硬或室温过低；若卷片，说明刀口角度不适或刀钝感。H)贴片：将切好的蜡片按需要分割成一定长短，用镊子夹放在预先准备好的温水上（水温以不会使蜡片熔散但要使蜡片充分展开为度），贴于预先清洗洁净的玻片上，用吸水纸吸去周围的水分，摆放在平盒中。I)烘片：将贴好的片子连同平盒放于温箱中（温度以低于石蜡熔点约5度），以蜡片下水分充分蒸发，蜡片充分紧贴于玻片上为度。J)脱蜡：将烘好的蜡片放置于纯二甲苯溶液中脱蜡（此为染片的第一步，在染色缸中进行），以材料周围洁净、清晰为度。K)染色：脱蜡后，将片子转移至下一步。其步骤大致如下：片子（无蜡片）——二甲苯：纯酒精（1：1）——纯酒精——各级酒精——番红水溶液染色——水清洗（除去多余的染料）——各级酒精（脱水至95%酒精）——95%的酒精亮绿溶液二重染色（亦可用龙胆紫染色）——洗涤与脱水（95%—纯酒精）——透明（纯酒精：二甲苯1：1至2：1至纯二甲苯）——封藏（以加拿大树脂胶或光学树脂胶的二甲苯溶胶液封片）——烘片（在温箱中以低温约35度烘干或自然干燥）——贴签
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