逆转录-聚合酶链反应

：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。二、试剂准备1．RMA提取试剂2．第一链cDNA合成试剂盒3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4．Taq DNA聚合酶三、操作步骤1. 总RNA的提取：见相关内容。2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer 2μl25mM MgCl2 2μl10mM dNTPmix 1μl0.1M DTT 2μl轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。（4）于70℃加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。3．PCR：（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl上游引物（10pM） 2μl下游引物（10pM） 2μldNTP(2mM) 4μl10×PCR buffer 5μlTaq 酶（2u/μl） 1μl（２）加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。（３）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（４）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（５）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2．为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5．防止DNA的污染：（１）采用DNA酶处理RNA样品。（２）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
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