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    mRNA的分离与纯化

    真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾,通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1.3M醋酸钠(pH 5.2)2.0.1M NaOH3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10
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