组织和细胞RNA的制备

倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。4．4℃离心，12000g×20min。5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。7．4℃离心，12000g×15min。8．弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNA完全溶解（必要时可65℃水浴促溶）。9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min。10. 4℃离心，12000g×15min。11. 弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。12. 弃上清，将沉淀晾干。13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。（三）注意事项：1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。2．要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。TRIzol法TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。（一）试剂准备1． TRIzol试剂。2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC H2O配制）5．DEPC H2O（二）操作步骤1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。（三）注意事项1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。二、总RNA定量RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。
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