Southern杂交

μl限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl加ddH2O 至 500 μl在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DN-段范围。表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DN-段的范围琼脂糖凝胶浓度（%）分离DN-段范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。2. 电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。（一）试剂准备１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;３．转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2O至1000ml。（二）操作步骤1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。2.中和:将凝胶转移到中和液15min。3．转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。（转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）4. 转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80°C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。五、探针标记进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。2．在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling 5×buffer 10μl（含有随机引物）dNTPmix 2μl(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)BSA（小牛血清白蛋白） 2μl[a-32P]dATP 3μlKlenow酶 5U3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。室温或37℃ 1hr。4．加50μl 终止缓冲液终止反应。标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl。六、杂交Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。1．预杂交NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。2．杂交倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。七、洗膜与检测取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。七、注意事项1. 要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DN-段（大于15kb），可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。2. 转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。3. 转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。4. 注意同位素的安全使用。
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