PCR产物的克隆

72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。一、PCR产物的TA克隆1. TA克隆构建原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。2.操作步骤⑴ 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。⑵ 10μl体积反应体系如下：　①取T载体1μl (50ng)，加入等摩尔数PCR产物。②加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH2O 补足至10μl 。⑶ 稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr，或4℃过夜。⑷ 转染，蓝白斑筛选同前。二、注意事项1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3.在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
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