真核细胞DNA的制备与定量

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml
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