真核细胞DNA的制备与定量

l，转移到匀浆器中匀浆。⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。⑷ 60°C水浴1-3hr。2．培养细胞处理：⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。⑷ 50-55°C水浴1-2hr。（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。(三）DNA定量和电泳检测1.DNA定量：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。三、注意事项1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可参考有关资料进行DNA纯化。
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