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择性扩增产物凝胶电泳分析,从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多,很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理,减轻不同PCR产物电泳分离的难度,提高分离的准确率。(见示意图) 一、实验流程: 对照组的总RNA提取 mRNA完整性鉴定 实验组的总RNA提取 mRNA完整性鉴定 ↓ ↓ 锚定引物逆转录成cDNA 锚定引物逆转录成cDNA ↓ ↓ 采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增 采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增 ↓ ↓ 扩增产物进行凝胶电泳分析 ß 差异性条带的回收与第二次扩增 ß Northern杂交,Southern杂交再次确定差异性条带的真实性 ß 差异性条带的克隆、测序、分析,DNA及氨基酸序列联机检索 ß 以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因 序列及cDNA文库中的全长cDNA序列 ß 基因功能的鉴定: ①knock out ②dominant negative mutation ③原核系统或真核系统中的表达翻译。抗体的制 备,细胞内的定位,抗体抑活等等。 ④one hybrid判断出该基因的“启动”基因。 ⑤two hybrid判断出该基因的产物的作用途径。 这里以CLONTECH公司生产的DeltaTM Differential Display Kit为例,介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。 二、 操作步骤 1.总RNA的提取(见Northern 杂交)2.第一链合成:(1)总RNA样品 2μg;cDNA合成引物 1μl;加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。(2)混匀后稍离心。(3)70℃孵育3min,冰浴2min后稍离心。(4)准备dNTP mix (以5管为例 ) 每管 5管 5×第一链缓冲液 2μl 10μl dNTPmix(各5mM) 2μl 10μl MMLV逆转录酶(200u/μl) 1μl 5μl 5μl 25μl(5)每管加入5μl,混匀后稍离心。(6)42℃孵育1hr。(7)75℃ 10min终止反应后置冰上,稍离心。(8)将2μl反应液分别转至新管中(新管标号为1B,2B,PC B等)。(9) 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。(10)将72μl ddH2O分别加入A管中,混匀。(11)将所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。3.dd-PCR: 以 引物P1,T9为例说明 (0.5ml PCR管,1代表对照组,2代表实验组) 管号 cDNA样品 引物 (1) 1A P1,T9 (2) 1B P1,T9 (3) 2A P1,T9 (4) 2B P1,T9 (5) H2O P1,T9 (6) RNA1 P1,T9 (7) RNA2 P1,T9 以下为阳性对照反应体系 (8) PC 1A P10,T8 (9) PC 1B P10,T8 (10) PC 2A P10,T8 (11) PC 2B P10,T8 (12) H2O P10,T8 (13) PC RNA1 P10,T8 (14) PC RNA2 P10,T8 在PCR 管中加入:① cDNA样品 1μl P引物 1μl T 引物 1μl② 准备其它 PCR试剂的混合液: (在另一管中加入) 成分 每管(μl) 所需管数( n=14) 10×buffer 2.0 2n ddH2O 14.0 14n dNTPmix 0.2 0.2n α-32P dATP 0.4 0.4n Taq酶 0.4 0.4n 终体积 17.0 17 n 混匀后稍离心。③ 将17μlPCR混合液加入各反应管,则各管总体积为20μl。④ 开始PCR扩增。⑤ PCR循环参数: 在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序: 94℃ 5min 1 cycles 40℃ 5min 68℃ 5min 94℃ 30sec 2 cycles 40℃ 30sec 68℃ 5min 94℃ 20sec 23 cycles 40℃ 30sec 68℃ 2min 1 cycles 68℃ 7 min。⑥ 反应结束后置-20℃保存备用。 4.电泳和放射自显影(1)配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶,灌注测序板。(2)预电泳30min。(3)每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中,加5μl loading buffer,混匀,离心,置94℃变性2min。立即置冰浴。(4)停止预电泳,冲洗加样孔。(5)加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。(6)下胶:(同测序胶)(7)干胶:在胶表面覆上保鲜膜,80℃干胶30min。(8)X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。图2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片5.差异条带回收再扩增(1)X光片经D72显影、酸性定影液定影后,水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。(1) 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带,加ddH2O 20μl,沸水浴15min,离心取上清为模板。(3) 以原引物扩增: 回收DNA 7 μl 10×PCR buffer 5 μl 5mM dNTPmix 0.5 μl 引物P 2.5 μl 引物T 2.5 μl Taq酶 2 μl 加ddH2O至总体积为50μl(4) 执行PCR程序: 93℃3min;93℃1min→60℃1min→68℃2min,20次循环;68℃5min。(5) 取PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。(6) PCR产物乙醇沉淀,10μlddH2O溶解。6.以PCR产物为探针,标记后进行Northern杂交,证实基因的真实性。7.PCR产物的TA克隆。8.DNA序列测定。9.检索分析。 图2-6 dd-PCR放射自显影图 (三个泳道中反应了不同处理样品中mRNA表达的差异) < 1 > < 2 >
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