PCR/RT-PCR指南---测定PLATINUMTM pfx DNA聚合酶的保真度

fu Turbo™ DNA聚合酶，和1.25单位PLATINUM™ pfx DNA聚合酶，使用生物素标记引物AAA AAC GCG TCA CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT AC-3’（正向序列）和AAA AAC GCG TCA ACC AAG TCA TTC TGA GAA TAG-3’（反向序列）。使用1ng模板DNA时进行25个循环，10ng时进行15个PCR循环。PCR反应条件，94℃，2分钟，接94℃ 15秒，58℃ 30秒，68℃ 5分钟的25次或15次循环。百分之二十的反应物用于0.5×TBE的0.8%琼脂糖凝胶电泳，并用0.25μg/ml的溴化乙锭溶液染色。图1：rpsL保真性分析的示意图确定PCR产物是单一片段后，用链亲和素的磁珠来纯化。简述如下：PCR产物与等体积预洗过的磁珠混合。室温反应15分钟并轻轻旋转混合。离心回收磁珠，重悬于1×High Buffer[50mM Tris-HCl (pH=7.5), 100mM 氯化钠，10 mM 氯化镁，1mM DTT]，并用10个单位的Mlu I，37℃消化过夜以释放PCR产物。磁珠用一个磁性架回收，上清通过一个Micron-100微量纯化筒加以纯化。纯化的PCR产物在一个琼脂糖凝胶上分析，估计DNA浓度和模板加倍数目。DNA用T4 DNA连接酶在16℃连接2小时，然后转化MF101感受态细胞。细胞涂板于含氨苄青霉素的平板（100μg/ml）上来确定转化细胞的总数；涂板于含氨苄青霉素和链霉素（100μg/ml）平板以确定rpsL突变的总数。突变总数除以转化细胞总数来确定突变频率。突变频率除以130（造成rpsL表型变化的氨基酸数目）和模板加倍数来确定错误率。 LacZ保真性分析：扩增条件，PCR产物纯化条件，连接和转化条件与rpsL分析中使用的一致。但是利用pUC19作为模板；转化DH5 α™细胞。转化细胞涂板在含氨苄青霉素（100μg/ml），X-gal（100μg/ml）和IPTG（1mM）的平板上。突变转化子选择可通过白色克隆的生长来确定。野生型克隆呈现蓝色克隆。如果克隆颜色不清楚可再涂布于氨苄青霉素/X-gal/IPTG平板，37℃培养过夜。突变频率通过突变克隆总数除以转化细胞总数加以确定。错误率通过突变频率除以114（造成LacZ片段α-互补表型改变的氨基酸数目）和模板加倍数目来确定。结果和讨论： DNA聚合酶的保真性用两种分析方法来确定。LacZ保真性分析法已经广泛应用于错误率的确定。它是基于测定LacZ基因突变导致其在含X-gal的平板上产生的白色克隆。它需要大面积涂板，它会引入错误并导致不准返募剖Ｔ趓psL分析中，rpsL基因编码小核糖体蛋白，S12，它对链霉素敏感。PCR诱导的突变使细胞获得对链霉素的抗性。含链霉素的平板上的正筛选可对突变体直接选择。另外，rpsL分析背景较低，因为rpsL的自发突变率低至10-6，而LacZ则为10^(-3)到10^(-4)。 RpsL保真性分析结果显示PLATINUM™ pfx DNA聚合酶的错误率比Taq DNA聚合酶低26倍（表1）。PLATINUM™ DNA聚合酶是DNA聚合酶和抗DNA聚合酶抗体的混合物，适用于高特异性的自动热启动PCR和促进高通量筛选。加入Taq DNA聚合酶抗体[产生PLATINUM™ Taq DNA聚合酶]对保真性没有影响。 Enzyme Mutation Frequency(%) Template Doubling(for 25 cycles) Eorror Rate(×10^(-6)) Relative Fidelity Taq DNA Ploymerase 4.00±0.09 11 42±19 1 Platinum Taq DNA Polymerase 3.4±0.5 10 38±5 1.1 Pfu DNA Polymerase 0.3±0.1 10 3±1 14 Pfu Turbo DNA Polymerase 0.27±0.07 11 2.4±0.4 17 Platinum Pfx Polymerase 0.14±0.04 12 1.6±0.5 26 表1：用rpsL分析测定DNA 聚合酶的保真性。结果是5次独立的rpsL分析（2次25个循环和3次15个循环）结果的平均值±SD。对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下，Taq DNA聚合酶（1,892/56,455），PLATINUMTM Taq DNA聚合酶（2,043/57,695），pfu DNA聚合酶（1,033/395,469），pfu TurboTM DNA聚合酶（1,068/395,468），PLATINUMTM pfx DNA聚合酶（960/584,230）。用LacZ保真性分析获得了相同的保真性数据（表2）。在所研究的几种DNA聚合酶中，PLATINUM™ pfx DNA聚合酶有最低的错误率。 Enzyme Mutation Frequency(%) Template Doubling(for 25 cycles) Eorror Rate(×10^(-6)) Relative Fidelity Taq DNA Ploymerase 3.1±0.3 14 19±3 1 Pfu DNA Polymerase 0.18±0.03 11 1.1±0.4 15 Platinum Pfx Polymerase 0.09±0.01 11 0.67±0.06 29 表2：用LacZ分析测定DNA 聚合酶的保真性。结果是2次独立的LacZ分析（1次25个循环和1次15个循环）结果的平均值±SD。对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下，Taq DNA聚合酶（2,975/93,688），pfu DNA聚合酶（185/109,289），PLATINUMTM pfx DNA聚合酶（96/107,655）。所有突变克隆都重新涂布并在37℃培养过夜以进行第二次真正突变体确定。酶的保真性会被缓冲液或其附加物所影响。PCRx增强溶液，它是针对高GC含量的模板的PCR反应的共溶剂，也在rpsL分析中进行了评价。PCRx增强剂能提高Taq DNA聚合酶的保真性2倍（图2）。PLATINUM™ pfx DNA聚合酶的保真性不被PCRx增强剂所影响（数据未显示）。另外，在扩增反应中，当多种不同PCR缓冲液应用于pfu DNA聚合酶或PLATINUM™ pfx DNA聚合酶时保真性没有明显变化（数据未显示）。图2. PCRx增强溶液对Taq DNA聚合酶的保真性的影响。用rpsL分析来确定在扩增反应中含有或不含PCRx增强液时Taq DNA聚合酶的错误率。数值是平均值±SD（N=2）。
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