PCR/RT-PCR指南---PCR扩增产物表达的快速方法(11)

完成高水平表达——载体携带强大的表达启动子。 • 节省工作时间 Directional TOPO克隆试剂盒用拓朴异构酶Ⅰ代替了连接酶，传统的限制性内切酶过夜孵育的克隆方法被只需5分钟的拓朴异构酶介质连接的方法代替，这样大缩短了你的工作时间。pET和 pcDNA3.1试剂盒和Directional TOPO试剂盒提供了线性的和无需介质就具有活性的拓朴异构酶I的载体。Directional TOPO试剂盒的全部克隆程序，只有三步并且90%以上的重组克隆表达出正确的排列。省略了克隆和筛选的步骤，大大加快了实验步伐。图33 Directional TOPO® Cloing 1. 用CACC设计引物5’端(引物3’端不用改动) 2. 用有校正功能的聚合酶扩增基因 3. 用Directional TOPO连接载体与PCR产物混合并转移到E.coli和平板 • E.coli(大肠杆菌)表达的快速方法在短时间内你就可以从PCR中得到E.coli的表达子， Directional TOPO克隆连接了三个pET载体：pET100/D-TOPO，pET101/D-TOPO，pET102/D-TOPO（图34）。图34 Directional TOPO连接的pET载体高效的pET载体：三个Directional TOPO pET载体都使用强的IPTC诱导的T7/lac启动子调节在E.coli中的高表达。另外，每个pET载体都提供了简单的蛋白检测和提纯方法或提高蛋白产量的方法（表11）。表1 Directional TOPO™连接的pET载体的融合配对载体位置融合标签优点 pET100/D-TOPO N-端 Xpress™,6xHis 分离检测和提纯标记 pET101/D-TOPO C-端 V5, 6xHis 检测和提纯 pET102/D-TOPO N-端 Xpress™, thioredoxin 分离标记提高蛋白转移浓度 C-端 V5, 6xHis 检测和提纯经证实的pET表达：使用Directional TOPO试剂盒连接pET载体，你能够得到和最初的pET载体相同的表达检测结果。与不使用TOPO的对照相比较证实表达结果来自于这些载体。（图35表示表达水平相同）。图35 Directional TOPO连接的pET载体的表达用Directional TOPO克隆试剂盒将lacz基因转入到pET100/D-TOPO, pET101/D-TOPO, pET102/D-TOPO并且用限制性消化的方法将克隆连接到没有被连接的pET15b和pET32a的载体上，将载体转移到BL21Star（DE3）E.coli，把每个菌落移植到1ml含有100μg氨苄青霉素的LB培养基中，加入1mM IPTG测OD值，OD600=0.5。测OD值1.5--2小时后将培养物离心，沉淀用300μl样品缓冲液重悬，每个样品取10μl用4-20%Novex?® Tris-Glycine凝胶分析1和2 pET15b/lacz3和4 pET101D-TOPO/lacz5和6 pET100D-TOPO/lacz7和8 pET102D-TOPO/lacz9和10 Pet32a/laczU=Uninduced I=Induced 快速进入哺乳动物细胞的表达广泛应用的pcDNA3.1载体连接到Directional TOPO克隆上提供了进行哺乳动物表达实验的快速途径。强大和可信赖的载体：强大和可信赖的载体 pcDNA3.1在过去的5年一直被成功的使用，并且它在哺乳动物细胞中一直具有高表达结果。如果你使用Directional TOPO连接pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体, 你将得到同样满意的结果。另外Directional TOPO克隆pcDNA3.1/V5-His-TOPO（图36）将提供： 1. 人巨细胞病毒起动子高表达。 2. 简化检测和蛋白提纯方法融合编码的载体C端V5组氨酸标记。 3. 用GENETICIN选择高效的稳定的转染哺乳动物细胞。图36 Directional TOPO连接的pcDNA3.1载体可信赖的结果：使用pcDNA3.1D/V5-His-TOPO产生的表达结果与没有Directioanl TOPO连接的配对物相同。（图37）图37 pcDNA3.1D/V5-His-TOPOβ-半乳糖苷酶的表达 PCR扩增LacZ基因并且用TOPO克隆试剂盒转入到pcDNA3.1D/V5-His-TOPO。将质粒用标准方法扩增，提纯。然后用磷酸钙的方法将质粒转染到7.5×10^4 COS-7细胞中转染后58小时，收获细胞。将总量10μg的蛋白加到SDS-PAGE凝胶上，用抗β-半乳糖苷酶抗体通过Western blot方法分析表达结果1. 模拟转染（阴性对照）2. pcDNA3.1/V5-His-TOPO/lacz3. pcDNA D/V5-His –TOPO/lacz 快速克隆高水平表达 Directional TOPO试剂盒给你提供了一个将克隆转入E.coli和哺乳动物表达载体的快速方法。将用少量的时间得到大量的表达结果。每个试剂盒有克隆平端PCR产物所需的所有试剂，包括足够的E.coli。
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