PCR/RT-PCR指南---PCR产物克隆(10)

图32 The TA Cloning® Concept Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit） Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。 Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。 Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基等。 1. Add 1ml of TOPO® Cloning vector to 1ml of the Taq-amplified PCR product 2. Incubate for 5 minutes on your bench top 3. Transform One Shot® Competent E. coli. Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning Kit）因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。 Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果没有DN-断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速。平端PCR克隆方法（Zero Blunt PCR Cloning Kit） Zero Blunt PCR克隆乃利用传统T4连接酶方法，但载体和Topo平端的一样，含ccdB基因，所以同样可降低菌落背景，易于筛选。表10 PCR克隆试剂盒的选择 Amplification Enzyme Application of Cloned PCR Product Ligation Method Product Advantages Cat. No. Taq DNA Polymerase •Sequencing•Safeguarding sample•In vitro transcription TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase TOPO TA Cloning® Kit •≥95% recombinants K4500-01K4550-01K4560-01 •Blue/white color screening TOPO TA Cloning® Kit Dual Promoter •≥95% recombinants K4600-01K4650-01K4660-01 •Blue/white color screening •Dual Sp6 and T7 promoter primer sites for in vitro transcription TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing •≥95% recombinants K4575-01 •Streamlined sequence analysis Ligase-mediated(overnight)T4 DNA ligase Original TA Cloning® Kit •≥80% recombinants K2000-10K2030-10 •Blue/white color screening Original TA Cloning® Kit Dual Promoter •≥80% recombinants K2050-01K2060-01 •Blue/white color screening •Dual Sp6 and T7 promoter/primers sites for in vitro transcription TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase Various •Fast cloning directly into an expression vector All the TOPO Exp. Kits Proofreading polymerase高确限度酶 •Expression of cloned PCR product TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit •≥95% recombinants K2800-20 •Positive selection resulting in low background Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing •≥95% recombinants K2875-20 •Positive selection resulting in low background •Streamlined sequence analysis Ligase-mediated(1 hour)T4 DNA ligase Zero Blunt® PCR Cloning Kit •≥95% recombinants K2700-20 •Positive selection resulting in low background Polymerase mixturesfor long Template混合酶 •Sequencing•Safeguarding sample•In vitro transcription TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase TOPO® XL PCR Cloning Kit •High-efficiency cloning of long (3-10kb) PCR products K4700-10 •Positive selection resulting in low background TOPO PCR表达克隆法传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，从而影响蛋白表达和蛋白的功能。利用TOPO克隆技术把PCR产物直接克隆至表达载体，则可避免这种情况。 Comparison of Cloning Strategies TOPO PCR表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR扩增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR克隆表达系统。
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