PCR/RT-PCR指南---PCR应用(9)

使用双核苷重复标记物确定基因型确定扩增的双核苷重复区域的大小较难，因为Taq DNA聚合酶经常在PCR产物中加入非模板核苷。在扩增反应中包含一个多余核苷的产物部分决定于序列和引物，并且差异很大。但Platinum GenoTYPE Tsp DNA聚合酶表现出最小的非模板核苷掺入，有助于增加等位基因长度决定的精确度（图28），仅需要用Platinum GenoTYPE Tsp DNA聚合酶替换在这些反应中所使用的Taq DNA 聚合酶就可以。图28. DNA聚合酶对双核苷重复标记进行基因定型的比较使用Taq DNA聚合酶或Platinum GenoTYPE DNA聚合酶对拟南芥nga 106位点的扩增结果检查多态性的工具 AFLP技术是一种用来对植物和微生物基因组DNA进行指纹分析的技术（图29）。RFLP、AP-PCR和RAPD也是同样的DNA指纹分析技术。RFLP是一种基于杂交的技术，其费时费力并需要大量基因组DNA。AP-PCR和RAPD是较快的，基于PCR的方法，但是都对反应条件很敏感，从而影响可重复性。图29. AFLP分析系统图解 AFLP技术结合了RFLP的可信性和基于PCR的指纹分析技术的简便性，从而使其成为一种易于获取信箱的方法。用AFLP技术得到的指纹分析可以作为鉴定DNA样品或分析样品间相似性的工具（图30）。图30. 典型的AFLP指纹分析使用AFLP系统Ⅰ和EcoRⅠ+ACC及Mse+CAA选择性引物对大豆生态型多态性进行分析。泳道1到9分别为生态型：Holladay; Morgan; Hytest; Essex; Bass; T135; P88; P188788; P83; P183495; P90; P190763。很多参数会影响AFLP的结果，包括引物中选择性核苷的数目。当选择性核苷增加时，扩增条带的数目就会减少。较大的基因组需要较多的选择性核苷，以扩增恰当数量的DNA，因为酶切较大的基因组DNA会得到更多的限制性酶切片段。模板质量也会影响AFLP结果。模板质量差会抑制限制性内切酶，从而导致不完全酶切而在凝胶上看到很少的扩增条带。AFLP可以适应模板浓度的变化，使用100ng到5μg的DNA之间观察不到差异。高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系 Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG（qPCR）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果。使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件，检测方法和设备。实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以精确、可重复地定量起始物质。Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG是一种方便使用的反应混合液，为定量分析进行了优化。它包含了PCR所必须的成分（如缓冲液，核苷酸，聚合酶）。只需加入您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。高产量和特异性的扩增 Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG提供了强大的PCR扩增，可以使用多个模板组。所使用的Platium® Taq DNA聚合酶具有抗体介导的热启动特性。这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增，使您得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠超越竞争者在产量和灵敏度方面，Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG都超越了竞争对手。在ABI Prism® 7700上，Platium® SuperMix-UDG比Universal MasterMix的灵敏度高2Ct（阈循环）。您可以更精确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应（图31）。图31. 使用Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG得到更高的产量和灵敏度利用竞争对手的Unviersal PCR Master Mix（蓝点）或Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG（红点），使用200nM的各种引物和100nM TaqMan®探针对人类基因组DNA（1pg-1μg）扩增。在室温下配制反应体系。在50℃进行UDG保温2min。PCR反应在95℃ 10min，50℃ 2min，然后95℃ 15s和60℃ 1min进行50个循环。高度灵活性除了灵敏度和特异性外，Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG在分析设置，检测方法和设备上给你提供了较高的自由度。使用Platium® SuperMix-UDG，您可以：对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于提供了附加的氯化镁，所以您可以方便地配置SuperMix体系。可以在多种设备上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan®探针和Molecular Beacon，您不必局限于特定的试剂盒。
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