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    PCR/RT-PCR指南---其他需要考虑的事情(8)
    扩增长目的片段 当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（参见第十三章，PCR聚合酶的比较和图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3-5外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3-5外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（带有3-5外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。 除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用18到24个碱基
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