PCR/RT-PCR指南---其他需要考虑的事情(8)

基得到较好的产量。防止残余（Carry-over）污染 PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。 PCR产物纯化残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。包括多次酚：氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。图26. 扩增后PCR片段的纯化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。引物36到40碱基长。将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后（泳道B）的洗脱液水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DN-段的技术。
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