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    PCR/RT-PCR指南---RT-PCR应用(4)
    第一链引物，GSP1，同mRNA退火 使用SuperScriptⅡ将mRNA转录成cDNA 使用RNase混合物降解RNA 使用GlassMAX® Spin Cartridge纯化cDNA 使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾 使用简并的锚定引物和巢式GSP2 PCR扩增带有dC尾的cDNA 使用AUAP，UAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物。 图11. 5 RACE步骤概要 5 RACE比RT-PCR更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因特异性的。5 RACE的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的GSP的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物扩增（最多可以三轮巢式扩增），并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加5 RACE的特异性（见第五章，巢式PCR）。增加逆转录保温温度和PCR退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。 5 RACE的灵敏度受所使用的逆转录酶和cDNA 3 末端抑制cDNA加尾（tailing）的二级结构影响。cDNA的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板产生连续条带。因为SuperScriptⅡ产生更多的全长cDNA，所以可以提高5 末端序列检测的水平，尤其是对于小于1kb的转录本。双链3 末端和发卡结构会通过减少用于加尾的3 羟基而破坏cDNA的加尾。cDNA的起始保温温度在94℃并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难模板可能需要加入DMSO辅助加尾（图12）。加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20％的DMSO。 图12. 5RACE   在45℃使用SuperScriptⅡ从5μg Hela总RNA合成cDNA。10μl纯化的cDNA在10％DMSO中加尾。使用人tuberous scleosis的引物和ELONGASE® Enzyme Mix（初步PCR 2.8kb；泳道1）对1μl加尾反应产物直接扩增40个循环。在2.8kb条带周边移取10μl的凝胶。使用1μl限定大小的PCR产物进行巢式PCR（巢式PCR 2.7kb；泳道2）。凝胶使用SYBR® GreenⅠ染色。 巢式PCR后如果看不到产物或仅观察到连续条带，可以使用Southern印迹检测产物。这需要了解序列内部信息以制备探针。 仅扩增全长cDNA末端的高级RACE方法 为了获得全长的cDNA 5及3末端序列，许多研究人员使用称之为cDNA末端快速扩增，或RACE的方法。传统的RACE方法得到的PCR产物含有全长及断裂的cDNA产物。GeneRacerTM试剂盒确保只得到含有全长cDNA末端的完整序列，使您得到更高效的结果并节省时间。 GeneRacer™的优点 确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重要。GeneRacer™是一种高级RACE技术，提高了扩增全长cDNA末端序列的效率。使用GeneRacerTM试剂盒，可以得到 • 完整序列   克隆基因片段的全长5和3末端以构建完整的cDNA序列 • 灵敏   得到每个细胞中拷贝数低至30的稀有转录本的全长5和3末端 • 长度   可以由转录本得到长度至少为9kb的cDNA 仅通过一轮PCR反应就可以得到这些结果。一般不需进行巢式PCR。 全长5末端选择 传统的RACE会得到多个PCR结果，因为其所使用的cDNA来源于断裂及全长mRNA。研究人员必须鉴定每一个 PCR 产物以获得带有全长5′末端序列的产物。GeneRacer™ 只针对全长的5′加帽mRNA，从而节省了花费在筛选大量PCR产物上的时间。图13 示意GeneRacerTM 的工作原理。RNA样品经CIP和TAP处理，保证GeneRacer™ 寡聚RNA仅同全长转录本连接。然后使用SuperScriptⅡ逆转录酶对这些转录本逆转录，得到的cDNA做为PCR的模板。GeneRacer™ 寡聚RNA序列做为GeneRacerTM 5′引物结合位点，这样，只有具有全长5′末端的cDNA才会被扩增。使用GeneRacer™ 步骤及高保真度Platinum® Taq DNA聚合酶，就可以确保得到最高效的实验结果。 图13 GeneRacer™步骤 图14 稀有转录本和长转录本的扩增结果 3.5mg Hela总RNA经GeneRacer™步骤处理，利用GeneRacer™的Oligo dT引物和SuperScriptⅡ™得到cDNA，然后使用GeneRacerTM 5′引物和基因特异性的引物PCR扩增。基因经过30-35个循环的一轮PCR扩增。50ml PCR扩增产物中的15ml在1.2％E-Gel® 琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下观察。 泳道1: HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），1.3kb，30拷贝/细胞 泳道2: SMAP（胸腺激素受体共激活蛋白），3.1kb 泳道3: Cleavage and polyadenylation specificity factor，4.5kb 泳道4: TFRC（转铁蛋白受体），5.0kb 泳道5: IGFⅡR（类胰岛素生长因子Ⅱ受体），9kb，5′末端GC含量90% 敏感性和扩增长度 为了说明GeneRacer™试剂盒获取全长5′末端的能力，我们扩增了带有已知转录起始位点的基因的5′末端。使用总RNA，遵循GeneRacer™步骤，我们扩增了一个长转录本（9kb）和一个浓度为0.01%，即30拷贝/细胞的稀有mRNA。 长度超过GenBank序列 除了可以获得已知转录起始位点基因的全长5′末端，GeneRacer™还可以获得未知转录起始位点基因的5′末端。将GeneRacer™所得到的序列同GenBank列出的mRNA序列相比较，GenBank的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中的cDNA，这导致末端核苷酸的缺失。从表4可以明显看出，使用GeneRacer™得到的5′cDNA末端要比GenBank中列出的序列长16到116碱基。 Gene GenBank Number(mRNA) Size(kb) GeneRacer™ Sequence Beyond GenBank Heterogeneous nuclear ribonuclear protein complex K protein(hnRNP K) S74678 2.3 +62 Subunit for coatomer complex X70476 3.1 +38 Muscle phosphofructokinase(PFKM) M26066 2.8 +16 ADP-ribosylation factor 4(ARF4) M36341.1 1.5 +116 Isoleucil-tRNA synthetase U04953 4.5 +49 Putative tumor suppressor(LUCA 15) U23946.1 2.6 +81 Thyroid hormone receptor coactivating protein(SMAP) NM_006696.1 3.1 +52 Cleavage and polyadenylation specificity factor U37012.1 4.5 +57 Human insulin-like growth factor 2 receptor NM000876 9.0 +44 表4说明 列出的基因使用GeneRacer™步骤扩增。PCR产物使用S.N.A.P.凝胶回收柱回收并克隆至pCR®4-TOPO®载体（Invitrogen）。对每一个基因都随机挑选了12个克隆并测序。序列同GenBank数据库中的序列相比较，确定5′末端超出的序列。使用每个基因所获得的最长序列比较统计超出GenBank序列第一个碱基的超出碱基的数目。 获得全长的cDNA序列 GeneRacer™试剂盒确保您成功获得mRNA转录本的全长5′和3′序列。每个GeneRacer™试剂盒中包含CIP、TAP、RNA连接酶、SuperScriptⅡ™ 逆转录酶等酶类及其缓冲液，GeneRacer™寡聚RNA，GeneRacer™ Oligo dT引物，GeneRacer™ PCR引物及RNase抑制剂。同时试剂盒中还包括S.N.A.P.凝胶纯化柱以纯化PCR产物，还有TOPO Cloning® 试剂盒以进行下游测序。使用GeneRacerTM 试剂盒，您可以高效地得到全长的cDNA 5′和3′末端序列，而不必浪费时间筛选部分缺失或断裂的序列。 mRNA表达定量 mRNA表达定量是一种挑战性的RT-PCR，但是提供了超越传统RNA分析方法的优点。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及序列信息较少。但是RT-PCR涉及两个酶反应，这会导致RT-PCR产物量的波动。RNA转化成cDNA的量会影响产量，但定量PCR的主要困难是PCR的指数增长的特点，样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异。两个常用的mRNA丰度定量方法是竞争性定量PCR和实时PCR。 在竞争性PCR中，逆转录之前加入一个外源的RNA转录本（内部标准RNA）作为样品间差异的对照。内部标准RNA被逆转录并同目的模板一起扩增，作为cDNA转化和扩增效率差异的对照。通过将特异性的目的序列同已知浓度的内部标准RNA一起扩增进行定量。通过比较由内部标准获得的信号和目的模板所获得的信号可以确定目的模板的丰度。 内部标准RNA同目的模板有同样的引物识别位点。有几种现行的方法可以得到内部标准。最简单的方法是使用PCR在非特异性的spacerDNA上建立引物识别位点。产物可以克隆至带有T7或SP6 RNA聚合酶启动子的载体上，或者将RNA启动子序列加到正向引物，从而可以通过PCR构建序列。然后可以通过体外转录得到RNA标准。竞争性定量PCR可以使用GSP在一步法RT-PCR中进行，或使用GSP或oligo(dT)在两步法RT-PCR中进行。可以向反向引物中加入poly(dT)序列得到oligo(dT)序列。 竞争性RT-PCR是一种终点分析法，需要目的模板和内部标准的扩增效率相同。需要预先了解起始目的模板的部分信息以建立内部标准的浓度范围。为了精确定量，需要进行内部标准比目的模板多及少的反应。 实时RT-PCR是非竞争性的，在产物形成的同时就进行了检测。几种探针可以用于产物量的分析，如荧光标记的5核酸酶探针和Molecular Beacon。第一种方法基于Taq DNA聚合酶的5核酸酶活性，其可以切除延伸过程中在分支点的杂交探针。分析使用两种荧光标记的探针，一种染料作为报告基团，另外一种在探针被切除时淬灭信号。 Molecular Beacon包含一个5 flurophore和3 quencher。这些探针设计有一个带有荧光的发卡结构和紧邻的quencher以淬灭荧光。主干结构包括5到7个核苷且富含GC。外层环状结构包含15到30个核苷且同把序列互补。当存在靶序列时，molecular beacon同靶序列结合，发卡结构松散开，从而产生荧光。 对于两种探针，使用与光激发检测装置耦联的PCR仪，在PCR的每个循环实时检测荧光。发出的荧光的量同PCR产物的量成正比。当释放的荧光的量超出了一个制定的荧光基线，这个循环称为阈循环或CT。CT同起始目的模板的量成反比。因此，高拷贝数的样品会有一个低的CT值，而低拷贝数对应高CT值（图15）。 图15. 眼癌mRNA的实时PCR定量 使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step System（在60℃进行cDNA合成）对Hela总RNA的相同两份样品进行PCR。在ABI Prism® 7700上使用FAM标记的Molecular Beacon探针（400nM）进行检测。A组. PCR期间两份样品的相对荧光密度。B组. 标准曲线。 为了对mRNA进行绝对定量，可以使用体外转录RNA得到标准曲线。通过不同浓度的体外转录RNA可以确定CT值。然后CT值可以同RNA浓度作图得到标准曲线，以定量未知样品的表达水平（图15，B组）。 实时RT-PCR提供了超越竞争性RT-PCR的优点。通过对大范围目的模板浓度进行线性剂量响应（图15），荧光监测高度灵敏，高度精确。样品不需要进行扩增后分析，仅需要预先知道很少的目的模板的丰度信息。可以使用两步法RT-PCR对一个RNA样品中的多个mRNA定量，在处理大量样品时，为了方便，可以使用一步法。 脱颖而出的定量RT-PCR Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统整合了最好的逆转录和PCR技术，提供了全方位的高品质。其产量、特异性和灵敏度都卓尔不群。您会得到mRNA最精确的实时定量。 如您所需 怎样做才能得到最好的定量RT-PCR（qRT-PCR）结果？把实时定量的逆转录和PCR的领先技术结合在一起就可以了。使用了Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统，您就拥有了两种高品质的酶，ThermoScript™逆转录酶和Platinum® Taq DNA聚合酶，以预先混合的方式，为精确可靠的扩增反应而优化。 高效的cDNA合成 ThermoScript™逆转录酶，一种克隆的鸟类RNase H-逆转录酶，通过基因工程处理，可以在最高65℃进行高特异性的cDNA合成，其最适温度为50℃。因为降低了RNase H活性，ThermoScript™逆转录酶增加了全长cDNA的产量。因为其较高的热稳定性，可以克服高GC含量和RNA二级结构的障碍，在较高温度下进行高效的cDNA合成（图16）。 图16 带有延伸二级结构的富GC RNA的RT-PCR得到高产量 使用ThermoScript™逆转录酶或AMV逆转录酶，根据生产厂商的建议，由10 ng 总RNA合成cDNA。将反应产物的1/10使用高保真Platinum® Taq DNA聚合酶扩增。圈出的带（414bp）表示核糖体大亚基RNA 5端（84％ GC）含量的扩增。 高产量和特异性 在ThermoScript™逆转录酶后，您会用到Platinum® Taq DNA聚合酶，其在PCR一步中提供了抗体介导的自动热启动功能（图17）。这项技术明显减少了错误配对和非特异性扩增，在高特异性的同时提供了高产量。cDNA合成和扩增的优异结果一起成为成功qRT-PCR的基础。 图17 室温条件下DNA聚合酶活性的完全抑制 对Taq DNA聚合酶和Platinum® Taq DNA聚合酶的活性分析在37℃进行5个小时。 一步得到高灵敏度 Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统提供的步骤可以高灵敏度地检测起始物质。仅需在反应混合物中加入总RNA或poly(A)＋，基因特异性逆转录和扩增引物及荧光探针，然后就可以开始实验了。您可以精确定量到最低10个目的RNA分子或从1pg总RNA（图18）。除了高特异性外，一步法步骤减少了反应变量，降低了污染可能性，适合高通量应用。 图18 一步法RT-PCR β-actin mRNA的定量。使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统扩增六份不同量的Hela总RNA，然后在ABI PRISM® 7700上，使用6-FAM标记的TaqMan®探针检测。使用了TAMRA做为报告信号（Rn）均一化的被动参考。 超越竞争对手 总而言之，领先的逆转录和PCR技术同一步法整合在一起会尽您所需，产量、特异性和灵敏度，得到高水平的qRT-PCR。图19将使用Platinum®Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统与使用竞争者系统得到的结果做了比较。Platinum®系统表现出更低的Ct（阈循环）和更高的产量，使其对于检测低拷贝的mRNA转录本更敏感。 图19 使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统获得高产量 使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统（蓝点）或竞争对手P的Quantitative One-Step RT-PCR系统（红点），按生产厂商的建议，对145bp的β-actin片段进行qRT-PCR分析。起始RNA从5μg到50fg按10倍递增变化。使用TAMRA做为被动参考收集均一化的相对荧光（Rn）。图版A：线性量扩增图。图版B：标准曲线图。 获得一步法的成功 Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统提供了实时定量中领先的逆转录和PCR技术。
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