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PCR/RT-PCR指南---增加RT-PCR特异性(3) |
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起始cDNA合成 第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法,各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火,产生短的,部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA,需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA,所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2%,所以与使用随机引物相比,cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性,oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适 < 1 > < 2 >
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