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    PCR/RT-PCR指南---PCR和RT-PCR基础(1)
    Final Concentration Template 10^4-10^6 copies of DNA template Primer 1 0.1-0.5µM Primer 2 0.1-0.5µM 10X Reaction buffer 1X Magnesium 1.0-3.0mM dNTP mix 200 mM each dNTP Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction RT-PCR基础 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 图1. RT-PCR概图 这本指南阐述了成功RT-PCR和PCR的关键。高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功PCR的标志。可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的RT-PCR和PCR。
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