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siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.二、如何进行RNAi试验(一)siRNA的设计1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：http://www.genesil.com/business/products/order2.htmhttp://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=453587102.RNAi目标序列的选取原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） (3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。3.阴性对照一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到： http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.htmlhttp://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.htmlhttp://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published(二)siRNA的制备目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。体外制备1.化学合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素2.体外转录以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。 共3页: 上一页 1 [2] [3] 下一页
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