增加PCR特异性

1、引物设计细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。2.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。3.设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。4.避免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。5.避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。6.避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计兼并引物。兼并引物是指代表编
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