子交换吗？和复性后再做比起来哪个效果好呢？非常感谢！！ 浓度太低一些杂带是很难出现的,所以这样的纯度很难说,我觉得得浓度高到25mg/ml左右,这样做电泳才能看得清楚些到底纯不纯.如果你是变性条件下做凝胶过滤没有意义,因为这时候蛋白是链状分子或者是不蜷曲的,不是球型,所以在这样的柱子中没有办法使他们分离,你最好的方法是优化你的亲和纯化条件,也可以在纯化前做好预处理,如果是包涵体,可以用分级沉淀的方法来初纯,亲和柱子的缓冲液中加点土温或者用pH洗脱和咪唑洗脱的方法配合,同时用阶段洗脱的方法,一般都能做得很好,用试剂盒的方法或者线性洗脱的方法有时候很难得到好的效果,你也许可以参考我们的方法,你留下邮箱我给你发一份做参考吧.我觉得离子交换也不一定好,在脲这样的变性剂下可以做离子交换,但是效果也不一定好,我觉得还是优化亲和条件更有意义.此外浓度太低很难纯化. 3)重组蛋白A琼脂糖凝胶FF能一次纯化大量血清IgG吗？如几十毫升。如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清IgG，先要偶联其相应配基如抗体或蛋白A是吗？这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么？ 几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的重组蛋白A琼脂糖凝胶FF就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非特异吸附,是个不错的方法. 4)谢谢色谱兄，能告诉我分级沉淀的具体操作步骤和缓冲液中添加吐温的浓度吗？ 分级沉淀包涵体其实很简单,用6M盐酸胍溶解包涵体,然后用缓冲液稀释到5M,然后混匀离心,上清继续稀释到4M,如此类推,一直到1M,这样把每次的沉淀和上清跑电泳,就可以知道在哪个浓度下包涵体中目标蛋白是最纯,而且收率是最高的,这样得到的包涵体蛋白比普通的洗涕方法要干净而且纯净,再纯化就好多了.加吐温很简单只要在平衡和洗脱的缓冲液中加0.5%吐温可以降低非特异吸附,使洗脱的蛋白更纯,其他的操作和一般没有什么差别,材料我已经发了,请查收. 5)兄，请教一下如何测柱效呀！谢谢先 一般柱效是常用1%的柱床体积的丙酮过柱子,柱效=柱高/理论塔板数,而每米理论塔板数=5.54/(Ve/W1/2)2,其中Ve是保留体积,W1/2=半峰宽,一般很少测定这个值. 我的是1毫升的预装柱，因为上样环最小100微升，所以就上了100微升的丙酮，然后用蒸馏水冲洗，没有峰出来，后来我用2毫升的NACL冲洗了5个柱体积，还是没有峰出来，然后我想里面可能没有物质了，就用蒸馏水想冲平，结果出现了3个峰都搞不懂是些什么物质。丙酮测柱效的时候洗脱液不是用蒸馏水1的吗？ 1ml的预装柱根本不需要测定柱效的，如果不是凝胶过滤也许需要，如果是亲和和疏水等没有这个必要，你不出峰我觉得是检测波长不对，因为丙酮在280估计吸收非常弱，你得换个波长，洗脱水就可以。后面出的应该是杂质。6)chromatography兄：您好！因为我对色谱一窍不通，所以有一些基本的问题想请教于您。我现在正准备用HPLC分离提纯一种细菌的外毒素，它是一种碱性丝氨酸蛋白，分子量大约是33KDa，按照文献的方法，是先用硫酸铵分级沉淀后再上疏水柱（HIC, phenyl sepharose high performance, Pharmacia)，然后再用凝胶过滤柱（(with Superose 6 HR10/30, Pharmacia)，我查了一下，这两种柱子好像都是预装柱。我想问你的是，什么情况需要发放大？是多大的量？我只是想分离出来做单抗和测序以及做免疫保护性，那么需不需要放大？另外：这样的两根预装柱加起来差不多要花4000美元，代价太昂贵了，那么有没有便宜的柱子且纯化效果也不错的？最后一个问题：如果我想让公司代为纯化，您觉得可行吗？如果可行，请问你知不知道哪里有这样的公司？ 你好，其实你这个纯化不一定需要专门的预装柱，当然你要用也可以，我们公司就有苯基琼脂糖凝胶柱子和填料，你要做多大都可以，至于凝胶过滤Superose 6是比较贵的，何况是预装柱，你可以用sephadex G-50应该也可以，这样组合会比较便宜，公司做纯化一般是比较贵的，你做多少量呢，一般钱给少了公司觉得不合适，多了，你觉得贵，纯化这样的蛋白估计也上万元，而且看你难度不同收费也不一样，我觉得你还得自己做。你做的量估计不需要多大，100mg足够用了吧。这样不需要多大的柱子就可以。 7)蛋白在合成中形成了醋酸盐，请问如何分离纯化和检测？谢谢！ 不很明白,电泳不能检测吗,也可以用HPLC的凝胶柱子去检测,纯化和成盐关系不大,只要调pH应该就成游离的蛋白了.不知道你的杂质都有哪些,很难说用什么方法. 8)我的蛋白等电点预测是6.5，应该选阴离子柱，但是目的蛋白和一些杂蛋白都穿过。但用阳离子CM柱后却能挂柱，经洗脱后纯度很好。请问这该如何解释？ 这个很正常,你的这个蛋白用阴柱或者阳柱都可以,因为它的等电点在中性,所以都可以用,至于穿过也许pH不够高,或者吸附力弱,再不就是预测有偏差. 9)在做HPLC之前要求将样品过滤，但是我的样品过滤以后就没有活性了，有可能样品与超滤膜结合了（但活性丢失的真正原因我不能确定）。现在想问色谱兄，怎样进行该蛋白质的进一步纯化！ 样品过滤不该用超滤的膜,用普通的0.22um的膜就可以了,没有活性那蛋白也没有了吧,我怀疑是超滤膜把蛋白截留了,这样样品当然没有活性了 10)色谱兄你好！我买了WHATMAN的纤维素DE52阴离子层析柱，我想问一下，上样洗脱后，层析柱最后应洗脱到什么程度，是不是要基线跑平了才行？这样后下次使用，用不用再生？怎样再生，用碱还是用酸？多大浓度？DE52规定使用的pH范围是2－9.5。怎样贮存好？ 应该洗到基线.用完最好用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用水洗,保存可以保存在20%的乙醇中也可以,其实你应该按照说明书的去做,我好久没有用过这个填料了.其实用DEAE琼脂糖凝胶不是更好吗,这个填料有点老. 11)我准备用Gravity－flow柱纯化蛋白，但没有独立的UV检测仪和收集器。能否在FPLC系统上直接运行，而不用启动泵？如可以要如何设置？或者有没有其他方法？ 不知道你用的是AKTA prime还是AKTA explorer, 有不少型号的，我觉得不好接，因为这些系统的管道很难靠重力可以流动液体，如果是AKTA prime也许好改点，你可以问他们的工程师吧 12)谢谢chromatography，因为醋酸分子量很小，用电泳或凝胶柱效果可能不好，现在主要是如何检测纯化后样品中的醋酸残留，因为没有对照品，测蛋白含量就不行了。能不能用醋酸对照，用离子色谱测醋酸含量呢？没做过离子色谱，不知道用什么检测器合适，请chromatography朋友指点。 你说的是检测醋酸呀,我以为你是要把醋酸和蛋白分开呢,如果是检测,如果是这样,你可以把你的样品加点盐酸,这样变成酸性环境那你的醋酸应该可以游离出来,毕竟蛋白会和盐酸成盐,或者用硫酸也可以,然后你用气相色谱的氢焰检测器就可以检测,而且很灵敏,这样应该就好了 谢谢，醋酸盐可以用GC测定，但若形成的是其它盐如硫酸盐或磷酸盐该如何测呢？ 如果是这些酸我可不知道怎么检测了, 这得看无机化学怎么分析这些酸了. 其实你的蛋白在碱性条件下就不会成盐了,没有这么复杂吧. 13)请教chromatography：最近我想做关于蛋白纯化方面的实验，因为是新手，所以想请教几个问题，谢谢！我的蛋白是70～80KD左右的，HIS标签，怎样确定是以可溶形式还是包涵体形式表达呢？若是包涵体是先让其溶解、复性再进行纯化，还是先纯化再进行溶解复性呢？我想用Ni+琼脂糖凝胶进行亲和纯化，应选用什么型号的填料呢？实验过程应注意些什么呢？ 破碎你的菌后, 有上清也有沉淀, 分别跑电泳, 如果上清有目标蛋白, 沉淀没有那说明是可溶的, 如果沉淀也有, 说明两个都有, 但是看哪个更浓, 如果沉淀更多, 那应该是包涵体.据说蛋白越纯越好复性, 所以我觉得应该先纯化再复性, 至于填料我们一直用我们公司的产品, 和进口没有什么差别, 我把我们的材料发给你一份, 里面很全面, 希望有所帮助. 14)我今天本打算试试你所说的分级沉淀法初纯包涵体，但仔细想想还是有点疑问，需要再请教你一下。1、具体的操作步骤是不是应该用含8M尿素的buffer来超声破碎菌液沉淀，然后把上清用不含尿素的buffer来稀释呢？2、稀释时是将上清分为几份分别稀释后离心，还是要先稀释到7M,离心，再把上清稀释为6M,依此类推呢？3、比如说我稀释到3M时沉淀里的目的蛋白最纯，那我下面是应该选择含3M尿素的buffer洗涤包涵体，再用含8M尿素的buffer溶解沉淀；还是应该直接用含3M尿素的buffer溶解包涵体，离心后取上清用于下一步的纯化呢？总之，我不太理解这样做的原理，还望不吝赐教，多谢！！！ 1,一般都是破碎后再用变性剂溶解包涵体, 不是先加的. 溶解后的上清再分级沉淀.2.是后面的那么操作,不是分几份.3.应该是得到的沉淀用8M溶解后再纯化,3M不溶解怎么纯化呢. 不好意思，再问一下，那我是不是应该先用一小部分包涵体试一下，如果发现3M最纯就直接稀释到3M. 还是摸好条件后还要分级沉淀至3M呢？另外，上清稀释后就可以直接离心吗？还是需要静置一段时间再离心呢？ 先试试,摸好了就直接稀释到那个浓度就可以了,一般最好静置一两个小时 每一步都要静置吗？那岂不是要很长时间？ 15)Hitrap的脱盐柱如何使用？我的样品是否需要浓缩后到1.5ml的体积再上脱盐柱，然后接样品即为脱盐后的样品。 我不知道你的除盐柱是多大的柱子,一般除盐可以做到20-30%的柱床体积,你根据你的柱子可以算出你能除盐的体积,你的预装柱都有说明书教怎么用,很简单,用平衡缓冲液冲柱子3个床体积,然后上样,再用缓冲液冲,收集蛋白峰得到的就是不含盐的样品. 16)1.我用酵母表达系统做肠三叶因子表达，如果用融合蛋白（c－myc）有利于纯化，但不知如何去除融合蛋白？2.如果不用融合蛋白，又不知如何纯化？ 据说这样的融合蛋白不需要酶切,改变温度或pH就可以自动切去,除去还用原来的亲和柱就可以,你也许可以带his标签,这样不大影响你的蛋白的结构和活性,如果不是融合蛋白,那得看你蛋白特性,用疏水,离子交换等常规方法去纯化. 17)请问chromatography老师，蛋白质糖基化修饰后其纯化时的条件与修饰前会有什么样的改变？我用毕赤酵母表达的蛋白可能被糖基化了，而组织中该蛋白是非糖基化的，用组织中的提取条件怎么也不能将我表达的蛋白提纯，应怎么考虑，怎么办？ 18)纯化糖蛋白可以用凝集素亲和或者硼酸亲和柱子去纯化,一般的蛋白不会被挂住. 19)我纯化的原核蛋白以可溶形式存在，但活性没有（含三对二硫键）。我看到一篇文章，发现蛋白经还原和烷基化处理后，活性出现。不知那位高手告知原因为何以及还原和烷基化的方法？ 我怀疑是二硫键错配,所以没有活性,当还原后再烷基化,这样不会再形成二硫键,也许这样导致蛋白有活性,还原的方法很简单, 加巯基乙醇或者DTT, 搅拌, 就可以还原, 烷基化,应该是巯基的修饰剂,常用的有DTNB,PDS,PMB(参考<酶工程>中的酶修饰章节) 20)关于蛋白质分离提纯方面,蛋白质的测定除了凯式定氮外,还有那些比较新而且权威的方法,（BCA法过时了吗）?分离纯化时疏水层析,凝胶过滤,离子交换等方法梯度洗脱时,洗脱液浓度是怎样变化的? 我可不是什么前辈,我们一般用BCA比较多, 没有觉得过时, 好象很多人都用这个方法.洗脱离子交换盐浓度由低到高,可以用梯度混合仪或者机器自己带的混合系统实现,当然也可以用阶段洗脱的方法,这样不需要专门设备,重现性好,很容易放大.疏水和离子交换刚好相反,开始是高盐,洗脱是逐渐降低盐浓度,洗脱方式也可以用线性或者阶段洗脱. 21)我发酵液中的目的蛋白含量少，所以想在等电点进行硫酸铵沉淀，请教仁兄：是不是用酸碱把我的发酵液ＰＨ调到目的蛋白等电点，再进行硫酸铵沉淀就可以了？能用强酸强碱吗，有什么注意事项吗？ 如果你的目标蛋白含量太低不大适合用硫酸铵沉淀,当然你要调到等电点附近去沉淀也许能行,得试试才知道,不知道这样蛋白是不是有活性,你只有试试才知道,你电泳要不浓缩看不见目标蛋白的话,用这样的方法怕很难有好的结果.你也可以把pH调到等电点用冷的丙酮沉淀试试.最好用弱酸,醋酸等非用强酸也要用浓度低的溶液.注意事项应该在搅拌情况下缓慢滴加,避免局部浓度过高,此外沉淀对蛋白浓度是有要求的,太低不适合. 表达的蛋白如果有亲和标签的话,不需要浓缩可以直接上柱,柱子本身就可以浓缩富集你的目标蛋白,如果没有标签,用离子交换或者疏水都可以浓缩你的样品而且可以初步纯化. 22)我想请教一下，我现在提取植物中的一种酶，含量可能很低（GUS酶），我直接用提取液来提取，然后经过80％硫酸铵纯化，结果感觉特别粘稠。是否多糖未除干净，有何简便的高招啊？另外，跑聚丙烯酰胺凝胶电泳时发现跑的极其难看，很歪，而且是一开始浓缩胶的时候就跑的歪歪扭扭的。（看溴酚蓝指示）最后染色是可以将所提取酶染成蓝色的一种染色剂，结果发现没有条带！真晕啊！我是第一次做蛋白相关的东西，请指教！ （GUS酶）是这个β-葡糖醛酸苷酶吗, 我怀疑没有提取好或者浓度太低所以电泳没有跑出来, 至于电泳开始就歪, 怀疑是你的样品溶解不好, 有沉淀或者盐干扰, 电泳最好先除盐, 此外浓度太低不能用硫酸铵沉淀, 我怀疑也许浓度低, 你要的也许还在沉淀上清里.多糖按理过离子交换柱子, 植物中的样品做得不多, 你多看看文献吧. 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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