好用离子交换，凝胶过滤，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么结合，那也许可以用亲和的方法，我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构，你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解，然后降低变性剂的浓度，这样类似分级沉淀，你就可以得到很纯的包涵体，再纯化就容易了，总之我建议你先分级沉淀包涵体，再做纯化。这样省事点。 请问什么是分级沉淀包涵体？ 参考这个帖子吧:http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=961391&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#961391 3)我的蛋白是水溶性蛋白，还有整个操作过程所用的缓冲液都一样。根据氨基酸来看等电点大概4，我的缓冲液PH为8。包涵体溶解液大概10ml吧，稀释成100ml透析去除SKL，然后PEG20000浓缩回10ml，取一半上Sephadex G－100，峰形很漂亮，SDS－PAGE检测去除了部分杂蛋白，收集峰再用PEG20000浓缩成5ml，上DEAE－Sephadex A－50，上样后可以看到柱顶部挂着蛋白，但是NaCl浓度从0.05M上升到0.8M只洗脱了杂蛋白，后来我怕是NaCl浓度不够又加到1.5M，还是不行。那你就把缓冲液pH调到6-7,然后再做纯化试试.我还是觉得因为沉淀所以洗不下来. 4)我是搞药剂的，想请教一个问题，我将分子量458.5的药物包裹在平均粒径约100nm（粒径范围50-400nm，材料为单硬脂酸甘油酯，分子量358.6，采用药剂学方法聚合成载药纳米粒，聚合后分子量我也不知道，只知道粒径）的纳米粒中，现想将游离药物和载药纳米粒分离，请问应该选用何种规格型号的Sephadex填料？文献有用Sephadex-G50的，我有Sephadex-G15，不知可否？谢谢！ 我原来也是学药的,根据你的说法那你的颗粒是比较大的,其实最简单的方法就可以用超滤这样处理量也大,快,便于放大,如果是少量用透析也可以,没有必要跑色谱,如果你想用,那Sephadex-G15不行,因为你的纳米粒过不去柱子,会聚集在柱子上面或中间,G50也也这些危险,你可以选择4-6%的琼脂糖凝胶,病毒颗粒等都可以穿过,这个填料更合适. 5)蛋白质去盐究竟是过柱好还是透析好？是否与柱子的质量有关系呢？ 都可以,看你手头有什么材料了,过柱子会稀释样品,透析稀释得少些,透析后还可以用peg浓缩,你喜欢用什么都可以.过柱子快. 6)我的目的蛋白PI9.0，用弱阳离子交换层析（CM52）分离，请问平衡缓冲液（PH3.75）与上样液（PH4.0）这样大的PH差距会影响目的蛋白与介质的结合吗？ 不会影响,但是为还是一致这样好一些. 7)请问chromatography ：我提纯的包涵体蛋白在经含不同浓度尿素的PBS中透析时析出来了，有什么办法可以复溶吗？我要用此蛋白去打动物。另外我的蛋白是用8M尿素裂解后用镍柱纯化的，洗涤液用的是含20ｍＭ咪唑，洗脱液用的是含250ｍＭ咪唑，但是纯化后跑SDS－PAGE发现，在洗涤液最后一管中己有我的目的蛋白，没有杂带，但在洗脱的第一管中就开始在紧邻我的目的蛋白的上方出现一条杂带，并随着我的目的蛋白洗脱浓度的降低而降低，后来我试用的增大洗涤液中咪唑浓度到40ｍＭ，结果还是一样，不知是什么原因，请问有更好的方法用镍柱纯化包涵体蛋白吗？如果我想纯化后不用透析就去打动物，有何方法呢？请多指教！谢谢！ 1.如果要溶解还得用变性剂,这样变性条件下可以免疫动物,不需要除去.2.你可以用你的抗体做WB看看是不是你的样品变成了聚合体.3.镍柱纯化包涵体有专门的总结的帖子,你可以参考一下.4免疫动物的问题你可以发到免疫版或者直接搜索就能找到相关的材料. 8)请问怎样在不引入其他杂质的情况下从阳离子交换层析（CM）纯化的蛋白中除掉核酸？谢谢！ 加到2M硫酸铵,上苯基琼脂糖凝胶,核酸被吸附.蛋白不一定能被挂柱,阳离子柱子通常不吸附核酸的,你蛋白能被阳离子吸附,而核酸不能,这样不就可以了.所以最简单的是使核酸和你的蛋白带相反的电荷,这样用阴柱或者阳柱都可以达到你的目的. 9)我做的原核表达GST-融合蛋白，用的是Glutathione Sepharose 4B的一次性小柱子，pharmacia公司的，经过反复试验，现在已经纯化出来了，期间曾得到你的指点，再次表示感谢！现在我要开始大量提纯蛋白了，为了节省时间，我想问一下有没有类似Glutathione Sepharose 4B的用于大量提纯蛋白的进口柱子，就是说不用自己配填料的，直接用的这种柱子？若有何处可买到？ 你需要多大的柱子呢,进口的好象只有5ml的预装柱,大的要自己装填,其实自己装是一样的,没有什么差别,我发了一些材料给你了,你可以考虑用国产的. 10)我最近买了一个Amersham的中空纤维浓缩换液柱，柱子的说明书上说能承受的最大压力为15psig, 不知道psig和MPa之间怎么换算啊？15psig相当于多少MPa呢？多谢！！ 1磅力/英寸2（psi）=6.895千帕（kPa）,所以15psi=103.425kPa=0.10MPa吧,你可以再问问他们的工程师吧,. 11)有在柱子上切的，也有纯化后切的，切下的片段可以用原来的亲和填料去除，凝血酶也需要去除的，你可以看下面的一些材料吧：http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins 如果用凝血酶切的话，怎样去除凝血酶比较好？谢谢！ 去除一般用肝素琼脂糖凝胶和苯甲脒琼脂糖凝胶. 12)我们在做多肽的纯化，都是制备用的，不知道该用哪家的填料，现在有很多厂家来推销，Vydac，Kromasil，YMC都有，不知道哪家的反相硅胶比较好呢？ 大的厂家都差不多,差别不大. 13)你说阳离子柱子通常不吸附核酸的，为什么我用PH4.0上样，PH9.0洗脱，洗脱液测紫外吸收值时总在260有很高的的吸收值，难道不是核酸，那会是什么呢？ 也许别的物质也这样把,你可以把样品跑一下琼脂糖凝胶电泳,看看是不是就知道了.核酸酸性如果不强,你怕pH提高到5-6,这样核酸应该就挂不住,你偏酸性太多,那也许有一些会挂住,你试试吧. 14)您好chromatography ，我是新手，现在正在做牛血蛋白质的纯化，希望得到纯化的白蛋白和IgG。打算用盐析的方法先粗提白蛋白和球蛋白，然后层析分级，再超滤浓缩除盐。现在遇到的困难是层析这部分，特向大狭您请教。白蛋白和IgG分别应选用哪种层析方法？填料选择什么？洗脱液具体选择什么（分段洗脱）？每次上样量最大能到多（制备型）？多长时间能过完一次？柱子的寿命一般为多少？洗脱液流速控制到多少？现在还没有做样品的电泳，所以还不知样品中杂蛋白和含量，只是在盐析中先用22%硫酸铵将纤维蛋白除去，用33%盐析出IgG样品，用50%除去拟球蛋白，用65%盐析出白蛋白样品。其中能提供以下数据①牛血清白蛋白：分子量：66210；分子形状：椭圆形；分子大小：40Å*140Å；等电点：4.7；血浆中的含量：52.0g/L。②IgG:分子量：15300；分子形状：球状；等电点：5.8—7.3;血浆中含量：2.0g/L。③另外，我从书上看到说：凝胶过滤在分级方法中分辨率为中等，但对脱盐效果优良；流速较低，对分级每周期约≥8小时，对脱盐仅30分钟；适用于大规模纯化的最后步骤，在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理，尤其适用于两种缓冲液交替时。 白蛋白最好用蓝色琼脂糖凝胶纯化,很好用,我们都用它专门去除白蛋白,你需要我可以把材料发给你,至于IgG可以用重组蛋白A琼脂糖凝胶一步纯化,很好用,当然你也可以考虑用疏水去纯化.白蛋白也可以用镍琼脂糖凝胶柱去纯化. 15)请问：sephadex系列, superdex系列的gel fitrition column 有什么不同？ 前者是葡聚糖凝胶,后者是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合的凝胶,所以前者刚性差,不容易做高分辨率的小颗粒,而后面的可以,刚性好,不容易因为pH,盐,压力而体积有很大的变化. 16)请问上HPLC的样品盐浓度过高是否影响纯化效果？ 那倒不会,但是盐浓度高和有机溶剂混合也许会产生沉淀堵柱子,所以还是要很小心,最好别有高盐 17)柱子一般寿命多久，保养好了能用四五年吗？每次上样量是否不得超过十分之一？用于装填柱子的reservoir在哪里买得到，中文名叫什么，不同规格柱子用的reservoir是否是一个规格？一般过一个柱洗脱液的流速控制在多少，大概需要洗脱液多少个柱体积，需要多长时间？ 除了凝胶过滤需要严格装柱子,需要装柱器,别的柱子都不用,至于上样量也只有凝胶过滤也上样的体积有关,别的色谱都不需要遵守,一般是根据载量来上样,于体积关系不大,洗脱也看你挂东西的多少,一般3个柱床体积,多的要5个柱床体积,时间多少看你的流速和你的柱床体积. 18)凝胶过滤怎么脱盐啊,我做凝胶的时候buffer是甲酸铵，本身就是盐啊 buffer毕竟是低浓度的盐，而您过了凝胶柱后，除去了样品溶液中的大部分的盐。 过柱子,除盐没有什么难的,很难在这里把整个操作写一遍,甲酸胺是可挥发性的盐,你浓度不高,物质稳定的话,直接冷冻干燥,或者真空干燥都可以去掉了,没有必要过柱子,我猜测你的是多肽,过柱子也去不掉盐. 19)我提的蛋白中老是混有大量的血红蛋白，干扰实验的后续工作，非常苦恼。请问有没有那种介质可以吸附组织蛋白提取物中的血红蛋白？20) 我们的苯基琼脂糖凝胶可以吸附血红蛋白,而且很牢固,我们以前做过,你可以用这个办法去除, 在通常不加盐的情况下就可以吸附血红蛋白。 21)DEAE－Sephadex A－50是离子交换加凝胶过滤，想请教chromatography它单纯的凝胶过滤分离范围多大？相当于Sephadex的什么型号呢？谢谢。 对这个填料不熟悉，没有用过，我觉得凝胶过滤相当于sephadex G-50，范围在1000-30000,但是它可用于纯化的蛋白分子量在30-200KD. 为什么范围和可用于纯化的分子量不一样呢？我的目的蛋白单亚基是18KD，该选哪个型号？ 你是想用它做凝胶过滤还是离子交换呢，你为什么不用琼脂糖凝胶系列呢，这个填料在高盐的时候床体积变化很大，不好用。 离子交换试了四个月不行，最近一次错用成了含PO3－的缓冲液，结果还没有开始往上加NaCl梯度蛋白就下来了，后来查资料才知道PO3－会和DEAE反应，不知道是否因此使这个柱子的离子交换失效，变成单纯的凝胶过滤，所以想知道和它相当的Sephadex的型号。 那何必呢,直接用凝胶过滤好了, sephadex G-50正好适合你的蛋白。 22)可是产品目录上说G－50分离范围是1000－5000，适用于脱盐，我的目的蛋白是18000啊。另外G－25有粗、中、细、超细颗粒之分，请问区别在哪里？ 23)我试做过两次CNBR活化亲合配基偶联，效果不太理想；希望能得到你的指点，听你说环氧活化琼脂糖凝胶有不少优点，请给一些活化及偶联的资料吧。 你偶联的是什么配基呢，环氧活化可以选择合适的亲和手臂，例如我们常用的有3-10个碳原子的手臂，而对于一些物质的纯化，没有手臂是不行的。此外环氧活化再偶联形成的键非常稳定不容易脱落，所以我们经常用这样的办法，我已经把我们的材料发给你了，其实这样活化的方法偶联的效率也很高，它还适合带氨基，羟基，巯基等配基的偶联，应用范围很广，我觉得是不错的方法。 24)镍柱选择哪个厂家性价比较好呢？ 国产的就很好，价格便宜，性能一点也不差于进口的，螯合好了镍离子，载量高。能少花钱的何必多花钱呢，其实所有这些厂家性能都差不多，没有太大差别。你就选择北京卓冠科技有限公司的吧，没有必要选择进口的，你pM你的邮件地址给我。我可以把相关的材料发给你。 25)我们实验室最近纯化了一批带His tag的蛋白，大部分为包涵体形式。用8M尿素超声溶解后，用amersham的镍柱纯化，结果均不是太纯。因为我的目的是想纯化后作为抗原做ELISA检测，为了防止与血清中的抗菌抗体起反应，必需得到很纯的蛋白。所以想请教一下还可以如何优化条件或结合哪些别的纯化手段？如果几种纯化方法联用的话,怎样的顺序最合理呢？ 一般通过一步亲和都可以得到不错的效果,没有必要多做几步,何况包涵体的蛋白用别的纯化方法效果未必好, 洗脱用阶段洗脱的方法,摸细致点, 相信会有好的结果的,你把你的邮件告诉我,我把我们的材料发给你参考吧. 26)我提取了一些水溶性多糖，但含大量的色素。我想用分子筛或离子交换将色素与多糖分开，不知可行吗？色素会不会粘在填料上将填料污染？ 只能说试试,色素种类很多,多糖也是如此,我也没有做过,只能试试. 你试试MCI GEL吧，这个东西分色素非常出色。你找这个公司要资料吧。[email protected] 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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