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有酶解的现象，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些抑制剂，然后再做对比，我觉得你考虑得很周到，这个也是值得注意的问题，但是纯化的过程时间不长，一般没有必要这么做，但是有的蛋白有降解的现象，那就加试试。 6)离子交换层析、亲和层析上样时样品的蛋白浓度可以达到5-10mg/ml？我觉得浓度是不是太大？ 抱歉，没有说清楚，我的意思是填料的载量大多在这个范围，所以上样的多少由填料对你的目标蛋白的载量有关，也和填料的性质有关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么关系，因为其中真正你的目标蛋白不一定很高，所以其实这样的浓度也没有关系，具体的量和浓度还是要经过实验才知道。 7)破碎菌体,加pBS缓冲液,目标蛋白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的蛋白是包涵体。 那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包涵体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是溶解不了你的目标蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。 8)你好，我最近做纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow做初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在冰箱里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪现象，整个胶变成了絮状，沉不实，我一看，旧胶里面是有很多絮状物（不是其它东西，也是胶）漂在上面，下面沉淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时分层了，絮状物在上面，下面是胶，我于是除去了上面的东西，把下面的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC处理了三次，完了，又变回当初的絮状态了，象稳定的絮状胶体一样，真不知到底怎么回事（也就是说加盐它就能沉，加水就絮状胶体），我的胶是不是不能用了？另外，我做亲和，目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉，我的蛋白是4聚体，是不是做SDS－page将它解离了？我打算做native看看，但是高效液相结果显示很纯的，只是主峰后面有个类似拖尾的小峰，不知道是不是没有分离开，想请你帮我指点一二，另外能不能介绍下亲和方面的资料，非常感谢你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析. 9)chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗? 我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?亲和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.这样的砂心漏斗试剂公司就有，不贵，一套也就300来元，没有抽滤还没有别的好代替了，也可以用中间夹膜的漏斗。至于你说的两条带，那按理你用底物类似物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢，你平衡用什么条件，洗脱呢，你用什么活化的填料，我觉得非特异吸附的情况是存在的，你可以改变洗脱的方式，通常这些非特异吸附是离子交换作用，你可以可以在平衡液里增加点盐，这样可以去除这样的吸附，此外你目标蛋白会不会降解，这样有小分子还一样被吸附，你可以通过抗体做WB看看，如果是这样，那只能在纯化过程中加一些酶的抑制剂来避免。我能想到的就是这两种情况了。 我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基，采用pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液平衡，洗脱是等PH条件下进行的，只不过改变了洗脱剂的浓度，从最大浓度洗脱的结果看，往往就少了其中一条带，你的解释我会认真思考的，亲和中存在离子吸附，是不是目标蛋白和杂蛋白的等电点很接近造成的？平衡液中加点盐，主要起什么作用？一般加多少？使用什么盐好那？如果是我的蛋白解离，这样的杂蛋白有没有什么别的方法洗掉（除了加酶的抑制剂）？ 你其实还是没有说清楚你活化的方法，看你的意思好象是环氧活化的方法，不知道你是怎么偶联的，如果你觉得是秘密，那也没有关系，只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附，总之要是氨基和羧基缩合的方法，难免有离子交换作用，溴化氰也是这样的，而如果是环氧活化的方法，那么就没有离子交换的非特异吸附，至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了，如果是因为降解，那也许用这样亲和的方法就得把条件摸更细致点，如果不行，那可以看凝胶过滤能不能分开，即使不是降解，你也可以考虑凝胶过滤，而从你反映的情况好象杂质是个酶，加点抑制剂看看吧。 真的谢谢你无私帮助，我来到这个公司之前，他们就已经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基』，我也不知道为什么，和经典的环氧等方法不一样，我们偶联剂用的是10个C，培基是带氨基的，硼氢化钠应该是还原剂的，基质是sepharose cl－6B，具体对这方面我不是很了解。我想最近作个native，和SDS对照一下，看看是不是降解，此外，这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。我就把胶放在柱子里，加上碱洗了三次，上面的水直接吸走，然后水洗，在加浓盐洗了两次，上面就漂浮着一层悬浮物，我小心再把它从上面吸走，之后在水里面好像就很好了，显微镜下我仔细看，与新胶没什么区别，谢谢你的帮助哦，我只是没有砂心漏斗，没法子试试而已。活化的方法是什么？我自己都不清楚. 10)1、我们用CM52大量纯化某蛋白，经常会碰到介质裂缝，不知什么原因？2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗？如果为5/7会对分离有很大影响吗？用PB或ABS平衡时你们一般用多少柱床体积？3、我们用5KD超滤浓缩后蛋白的损失很大，能否帮忙分析一下原因（PALL 的超滤器）？ 那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也都是这样的就可以，没有刻意要求，5/7应该影响也不大，当然如果你走线形梯度洗脱，也适当把这个比值增加点，如果走阶段洗脱就没有关系。3。超滤膜本身的面积不小，这样也会吸附蛋白，特别是处理的量比较小的情况损失会很明显，如果量大，那损失会小的，此外如果蛋白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要特别小心，因为失活会很明显的。 11)我做的是原核表达蛋白质，目的蛋白是一个GST-融合蛋白，现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，正在做纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该只有目的条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条，但目的条带却不见了，1.为什么目的条带不见了？2、下一步应该怎么办呢？如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，缩短作用时间，在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是triton-100干扰结合，所以不能用，你用吐温也试试看，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的蛋白有降解现象，你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白，总之修改的方案就是我说的这几个，摸索一下吧。此外可以选择作用力更弱点的填料。这样特意性更好。 12)手头有碱性磷酸酶的资料吗？能否告诉我它的详细结构我想提纯谢谢拉最好还可以告诉我想关的提纯方法！它存在于细胞壁与膜之间,大概80K（四聚体）、32KD（二聚体）,它耐高温80度仍然保持活性（在有镁离子存在的情况下）,最适PH8.0我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱蛋白没有什么详细的结构吧，至于纯化它既然是碱性的蛋白，那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化，此外既然它能耐受80度，那你这样处理，大多的杂蛋白就沉淀了被去除，再上离子交换就应该有不错的效果。填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。 13)前几天我提取了一种菊科植物的蛋白，用的是tris—Hcl缓冲液，然后用100%丙酮沉淀蛋白，结果蛋白中含有色素杂质，属水溶性，颜色很深，请教高手，如何除去色素干扰，纯化蛋白？另外我也查了一些资料，说可能是花色素，于是我在100%丙酮沉淀后，加了一步0.1%甲醇，但是并没有显著的效果。你说的花色素就是黄酮类的花青素吗，它有很强的亲水性，所以丙酮沉淀它也沉淀，你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀，这样色素就不会被沉淀了，你试试吧。 14)用PB（pH6.8）或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积？10X够了吗？一般也就3-5个床体积吧，离子交换需要平衡体积大点也，10X足够了 15)有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教，我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%，进一步纯化，用什么柱子，具体操作又怎样做呢，谢谢赐教。我知道，我好象回复过，你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备，这样可以达到99%以上的纯度，别的方法很难做到你需要的纯度，此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。 HPLC制备你可以参考相关的文献，其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸，先是低浓度吸附，然后提高浓度洗脱，详细的条件和你做反相纯化是一样的，只是HPLC的分离效果更好。16)请问怎样可以查到protein的PI值？，多谢了先！已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.17)谢了chromatography兄，也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度. 18)chromatography兄:非常感谢回复，我手里也有一个GST融合表达的项目，经纯化后，用EK酶切时，出问题了。目的蛋白是12KD左右，PI约PH9.5。用PH8.0，0.1M NACL条件酶切时，反应液发混，全部沉淀，切出的蛋白（约12KD）经尿素溶解，透析后，PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0，2mM CaCl2条件酶切时,也有发混，但目的蛋白有14KD左右，PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题？另外，chromatography兄，有化学破菌及EK酶切相关文献吗？给我发一份好吗，E-mail:[email protected] 别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins 19)我想用DEAE纤维素来做填料我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢？DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素 DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢. 共2页: 上一页 1 [2] 下一页
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