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结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’-端与中间段的△G值应较高，而3’-端△G值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。6. 可能的错配决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错配可能个数越少越好，其结合的△G越低越好，最好没有错配,如此可以保证不出非目的产物的假带。7. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5kcal/mol，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。8. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。
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