地高辛标记cRNA探针

白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。　　（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。　　（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。　　（6）以PBs 漂洗2×3min。　　（7）浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封闭非特异性结合部位。　　（8）2×SSC漂洗15min。　　2．杂交以含cRNA探针（0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片10～2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃，16～18h或过夜。　　3．显示　　（1）用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。　　（2）在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。　　（3）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1：500，以缓冲液1稀释），孵育2h，室温。　　（4）缓冲液1漂洗3×3min。　　（5）浸入缓冲液210min室温。　　（6）浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。　　（7）将切片浸入缓冲液3以终止反应。　　（8）复染，可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁（又称派咯宁丫）（pyronin 丫）10～30s。　　（9）流水洗5～10min，直至水无色为止。　　（10）在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。
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