siRNA表达载体

多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段45—50nt的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）在哺乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。这一类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子等。采用RNA pol III启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列，总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，非常精确，而且还可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA。转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后克隆到相应载体的pol III 启动子下游。克隆的过程需要几天的时间，也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。现在有多个报道说通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。当这种带有PolIII 启动子和shRNA编码序列的
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