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1. 对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。美国著名RNA产品公司Ambion提供网上在线设计工具，帮助您更快地完成这项工作。网址为：www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html2. 选择低GC含量的siRNA Ambion公司研究发现GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。3. 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱（Ambion siRNA体外合成试剂盒中已包括纯化柱保证siRNA纯度）或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。4. 避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接
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