|
|
|
|
|
|
|
|
而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。 RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。 <1>试剂： 10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。 5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。 甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。 20×SSC； 去离子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH7.5。 <2>步骤： [1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 [2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。 [3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。 [4]55℃加热15min，冰浴冷却。 [5]加2ml5×载样缓冲液。 [6]上样、同时加RNA标记物。 [7]60伏电泳过夜。 [8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。 [9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。 [10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。 [11]20×SSC洗胶1h。 [12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 [13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。
< 1 > < 2 >
|
|
|
|
|
设为首页 | 加入收藏 | 广告服务 | 友情链接 | 版权申明
Copyriht 2007 - 2008 © 科普之友 All right reserved |
