固相膜核酸分子杂交方法

1．DNA的变性解链是杂交成功的关键,Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH中1小时，然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小时。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解、热变性要在低DNA浓度（100μg/ml）和低盐浓度（0.1 SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L柠檬酸三钠，pH7.0)下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml，加10mol/L NaOH使最终浓度为0.1mol/L（pH约12.8），室温变性10min，很快置冰盐水中，用10mol/L HC1或5mol/L NaH2PO4调pH到7-8(亦可用碱变性后，调至中性，再加热100℃后，调至中性，或只加热100℃10min)。DNA变性可用OD260增加（约30-40%）来检测，变性DNA醇沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。 2．变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径0.45um）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，凉干，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。 3．预杂交。
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