基因分离克隆的方法

文库、黏粒载体文库、人工染色体文库等。基因文库构建后，从文库中筛选基因的方法主要有以下几种：核算杂交法、免疫学检测法、DNA同胞选择法、PCR筛选法等。基因文库的构建是目前基因工程的核心工作，也是分离目的进的常用方法之一。3 功能蛋白组分离目的基因蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱、质普对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如：应用PCR进行分离目的基因：通过对蛋白质的序列分析，可以通过密码子的简并性设计简并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全长；应用核算杂交筛选法分离目的基因：即利用简并寡核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库；免疫雪筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。4 PCR技术在基因克隆中的应用PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。现在可用于基因分离和克隆的PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小节），用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及减法cDNA文库的PCR法构建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR为基因组已知DNA相临未知序列的克隆奠定了良好的基础。5 mRNA差别显示技术分离差别表达基因mRNA差异显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速行之有效的方法之一。它是将mRNA反转录与PCR技术结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。它利用5’锚定引物oligo（dT）12MN和3’端随机引物对总mRNA进行PCR扩增，以期得到差异表达的条带。并对其差异显示的条带进行回收、克隆。6 插入突变分离克隆目的基因获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。这里举T-DNA标签法和转座子诱变分离克隆目的基因的例子。T-DNA标签法是将T-DNA在任何感兴趣的基因处产生插入性突变，获得分析该基因功能的对照突变体。它将T-DNA左右边界之间携带的外源报告基因片段作为一个选择性的遗传标记，因为插入的序列是已知的，因而对获得的转基因重组突变体就可以通过各种克隆和PCR策略加以研究。倘若将35S强启动子在T-DNA整合到宿主基因组后，整合到内原基因的上游，则可以产生异常增加或表达的时空特异性改变而破坏基因的表达的效果。有获得性突变和功能丧失性突变等。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。7 图位克隆目的基因图位克隆的原理是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因机密连锁得分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登录的方法最终找到包含该目的基因的克隆，并通过遗传转化实验证实目的基因的功能。8 酵母双杂交系统分离克隆基因酵母双杂交系统体系可以发现蛋白相互作用的蛋白的编码基因。这种方法的用途有：验证已知基因间的相互作用；可以快速发现编码蛋白与蛋白间相互作用的特定区域；通过扫描文库与活化区域的作用可以发现相互所用的蛋白，只需一个质粒就可以直接得到编码蛋白的基因，无需制备抗体和纯化蛋白。操作相对简便、快速，不许经过蛋白纯化即可获得编码基因。9 生物信息学在分离克隆基因中的应用生物信息学是在生命科学的研究中，一计算机为工具对生物信息进行储存、检索、和分析的科学。基因组信息学的首要任务之一就是发现新的基因核心的功能，时发现新基因的重要手段。下举几例：利用EST数据库发现新基因（电脑克隆）：寻找到与克隆有关的EST后，用电子cDNA文库进行筛选；通过生物信息学软件进行分析和查询，最终获得一个基因的全长cDNA。通过保守区发现和可隆基因：即利用同源蛋白质的保守序列或同源基因火爆后区段进行电子筛选，在进一步拼接、延伸从而获得全长的cDNA。从大规模cDNA文库测序的序列中确定新基因：首先确定获得的cDNA是否为基因全长cDNA，确定是否有典型的ORF及3’端及5’端。而后可以通过网上搜索确定是否为新的基因，同源比对在判断是否为新基因，若通过检验则为新的基因。10 基因分离克隆的新技术除上述几种基本的方法外，随着生物技术的发展和传统技术的改良，基因可隆的方法又有许多新的技术出现。如基因表达序类标记分析（SAGE）；由DDRT-PCR演变而来的代表性差异分析（RDA），包括基因组DNA（gDNA）的RDA和cDNA的RDA；抑制型差减杂交（SSH）——基于反转录的双接头扣除的差异分析；转录活动的DNA差减杂交技术（TADSH）、利用限制性片段多态性的cDNA-AFLP等等。这些技术作为基因分离可隆的方法，较以前的技术都具有一定的优点，又有各自的不尽相同的用途。
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